【摘要】：目的：研究神經(jīng)酰胺、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、AMPK信號通路在氧化應激誘導的視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用及其相互作用機制。 方法： (1)以RPE細胞作為研究對象,采用H2O2(200μM)/UV處理體外模擬RPE細胞氧化損傷的凋亡模型；采用Western blot檢測細胞內(nèi)AMPK信號通路, TUNEL法檢測細胞凋亡；采用AMPK激動劑AICAR(1mM)和抑制劑Compound C(CC)(10μM)干預RPE細胞功能,TUNEL法檢測細胞凋亡的變化,探討AMPK信號在氧化應激誘導的RPE細胞凋亡中的作用； (2)建立RPE細胞的氧化應激模型,Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的變化；通過藥物Salubrinal (Sal)(10μM)處理干預內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激活性,評價內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在氧化應激誘導的RPE細胞凋亡中的作用； (3)建立RPE細胞的氧化應激模型,用放射自顯影法檢測細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量變化；添加神經(jīng)酰胺類似物C6(μg/mL)神經(jīng)酰胺酶從頭合成酶抑制劑fumonisinB1(FB-1)(10μM)預處理,TUNEL法檢測細胞凋亡的變化情況,明確神經(jīng)酰胺在氧化應激誘導的RPE細胞凋亡中的作用； (4)H2O2處理RPE細胞前添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑Sal預處理,Western blot檢測AMPK活化情況；添加神經(jīng)酰胺類似物C6預處理, Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及AMPK活化情況,研究三者在凋亡調(diào)控中的上下游關(guān)系。 結(jié)果： (1)經(jīng)H2O2/UV處理后的RPE細胞內(nèi)AMPK和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激均被激活；細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量增多。分別添加AMPK、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及神經(jīng)酰胺合成酶抑制劑預處理后的細胞凋亡受到抑制。分別添加AMPK激活劑及神經(jīng)酰胺類似物后凋亡水平提高。 (2)在H2O2/UV誘導的細胞凋亡模型中,添加神經(jīng)酰胺類似物可以促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和AMPK的活化；添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激抑制劑后可抑制AMPK的活化。 結(jié)論：UV/H2O2促進神經(jīng)酰胺生成后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑激活AMPK信號通路,以促進視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.5
【圖文】：

擇濃度為200^imol/L的H2O2構(gòu)建RPE細胞的氧化應激模型。處理時間在15分鐘至1小時均有明顯細胞調(diào)亡。如圖1可見，H202(200|jrnol/L)處理30分鐘后的RPE細胞出現(xiàn)大量細胞調(diào)亡，說明體外構(gòu)建H2O2誘導RPE細胞闊亡模型成功。^50-10) T N■■ i: II。iCtrl (200 |jM)圖1: TUNEL染色檢測H2O2對RPE細胞調(diào)亡的影響2. Western blot檢測H2O2對ARPE-19細胞內(nèi)AMPK活化的影響經(jīng)濃度為 200^imol/L 的 H2O2處理 15、20、60min 后，檢測 H2O2對 ARPE-19細胞內(nèi)AMPK相關(guān)活化蛋白表達的影響。選擇AMPKa和ACC作為標志活化蛋白。Western blot檢測結(jié)果顯示：RPE細胞內(nèi)AMPKa和ACCa愃嶧醮

本文編號：2750568