【摘要】：目的： 用可見光誘導的方法建立廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性(Retinal Degeneration，RD)模型，探索活體對豬形態(tài)和功能學進行檢測的方法并與離體組織學檢測手段一起對該模型進行鑒定。然后，初步探索將人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)誘導分化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(Retinal Pigment Epithelium，RPE)移植到光誘導視網(wǎng)膜變性豬視網(wǎng)膜下腔的手術(shù)方法，通過活體檢測方法觀察細胞移植術(shù)后的安全性、移植細胞和豬視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能學變化，為干細胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病最終進入臨床奠定基礎。 方法： 1.光誘導廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性模型的建立與鑒定 采用白色熒光燈持續(xù)間斷光照豬3個月以上，誘導豬發(fā)生視網(wǎng)膜變性，運用活體形態(tài)檢測方法-視網(wǎng)膜光學相干斷層掃描(Optical Coherence Tomography，OCT)以及活體功能學檢測技術(shù)-全視野視網(wǎng)膜電圖(full-field Eletroretinography，fERG)和多焦視網(wǎng)膜電圖(multifocal Electroretinography，mfERG)，對豬視網(wǎng)膜進行鑒定，并與視網(wǎng)膜組織切片HE染色和視網(wǎng)膜透射電鏡進行比較分析。 2.初步探索光變性豬行hESC來源的RPE細胞視網(wǎng)膜下腔移植的手術(shù)方法、及光變性豬術(shù)后的活體形態(tài)和功能學檢測 探索改良hESC-RPE細胞懸液視網(wǎng)膜下腔移植的手術(shù)方法，在術(shù)后利用活體檢測方法如檢眼鏡、視網(wǎng)膜B超、視網(wǎng)膜OCT、fERG、mfERG、等手段觀察移植細胞在光誘導視網(wǎng)膜變性豬視網(wǎng)膜下腔的存活、遷移、整合能力和術(shù)后豬視網(wǎng)膜功能的變化。 結(jié)果： 1.光誘導廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性模型的建立與鑒定 與光照前相比，持續(xù)間斷光照2-4月齡小型豬3-6月后，視網(wǎng)膜OCT檢查可見光變性豬視網(wǎng)膜全層(內(nèi)界膜Inner Limiting Membrane至RPE層)厚度顯著變�。籪ERG檢測發(fā)現(xiàn)光變性豬在暗適應最大混合反應的a、b波振幅和ops波振幅顯著下降，明適應反應的b波及p1波振幅也有顯著下降；mfERG檢測發(fā)現(xiàn)光變性豬視條紋區(qū)P1波平均振幅密度顯著降低。這都提示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了明顯改變。視網(wǎng)膜OCT顯示的外核層(Outer nuclear layer，ONL)厚度與離體視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色顯示的外核層厚度均明顯變薄，說明了視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生了損傷，活體OCT結(jié)果與離體組織檢測結(jié)果一致；視網(wǎng)膜透射電鏡發(fā)現(xiàn)感光細胞內(nèi)節(jié)線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡樣變，外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)破壞，視網(wǎng)膜色素上皮細胞微絨毛結(jié)構(gòu)破壞，進一步表明視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生了損傷，從超微結(jié)構(gòu)層面驗證了活體檢測方法的準確性。 2.光變性豬行hESC-RPE細胞視網(wǎng)膜下腔移植手術(shù)、及光變性豬術(shù)后的活體形態(tài)和功能學檢測 在本研究中，共對4頭光誘導視網(wǎng)膜變性豬探索進行了hESC-RPE細胞懸液視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)。第1批移植了1頭豬，在術(shù)后2周行檢眼鏡和視網(wǎng)膜B超檢查示并發(fā)性白內(nèi)障。換用手術(shù)顯微鏡及移植器械、改變手術(shù)方法后在第2批移植了3頭豬；術(shù)后2周行檢眼鏡、B超檢查示無白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥出現(xiàn)；術(shù)后1月時的視網(wǎng)膜OCT檢查示hESC-RPE細胞進入光變性豬視網(wǎng)膜下腔，移植細胞能夠存活，未見排斥反應；術(shù)后1月的fERG檢查示視網(wǎng)膜整體功能無明顯變化；術(shù)后1月mfERG檢查示0號豬移植區(qū)平均振幅密度高于對側(cè)偽手術(shù)眼，1號豬移植區(qū)平均振幅密度與對側(cè)偽手術(shù)眼無明顯差異，2號豬移植區(qū)平均振幅密度高于對側(cè)未手術(shù)眼。 結(jié)論： 1.與光照前相比，可見光光照廣西巴馬小型豬3個月以上，通過活體形態(tài)學檢測(OCT)、功能學(fERG、mfERG)檢測和離體組織學檢測(石蠟切片、透射電鏡)發(fā)現(xiàn)豬視網(wǎng)膜形態(tài)和功能均有顯著變化，表明光誘導視網(wǎng)膜變性小型豬模型建立成功。 2.構(gòu)建了活體對大動物進行形態(tài)和功能學檢測的平臺，通過對比活體OCT與離體組織切片對光變性豬進行形態(tài)學分析，均提示外核層變薄，說明活體OCT與離體組織學結(jié)果一致，利用活體OCT對組織學進行觀測具有可靠性；同時發(fā)現(xiàn)活體OCT對光變性豬的形態(tài)學檢測結(jié)果與活體fERG和mfERG的功能學檢測結(jié)果是一致的，表明其具有一定的相關性。 3.探索建立了hESC-RPE細胞懸液移植到豬視網(wǎng)膜下腔的手術(shù)方法，改進手術(shù)設備和方法后的3頭豬移植術(shù)后早期無并發(fā)癥發(fā)生，安全性較好。 4.光誘導視網(wǎng)膜變性豬行hESC-RPE細胞視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)后1月時,活體形態(tài)學檢測(OCT)顯示移植細胞在變性豬視網(wǎng)膜下腔存活，無明顯的排斥反應發(fā)生；活體功能學(fERG、mfERG)檢測顯示hESC-RPE視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)后早期對豬視網(wǎng)膜整體功能無明顯影響，但是在移植區(qū)局部有2頭豬出現(xiàn)多焦視網(wǎng)膜功能的提高。表明手術(shù)對光變性豬視網(wǎng)膜整體功能無明顯影響，hESC-RPE細胞移植可能會改善移植區(qū)局部視網(wǎng)膜功能。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.13;R-332
【圖文】：

圖 2-1 小型豬及光誘導造模室概況A：廣西巴馬小型豬；B：光誘導造模室(溫度 10-25℃，光強 2500lux)2.3.2 .光誘導視網(wǎng)膜變性豬模型的活體鑒定結(jié)果2.3.2.1 光誘導前后眼底視網(wǎng)膜照相的比較為了觀察光照前與光照后眼底有無異常表現(xiàn)，我們共對 7 頭豬 14 只眼全部光誘導前及光誘導后的同一部位的眼底照相�？梢姽庹T導后小型豬眼底照相圖誘導前眼底照相圖片相比，未見明顯的滲出、出血、萎縮等異常表現(xiàn)(圖 2-2.A說明了視網(wǎng)膜無肉眼可見的損傷。

圖 2-1 小型豬及光誘導造模室概況A：廣西巴馬小型豬；B：光誘導造模室(溫度 10-25℃，光強 2500lux)2.3.2 .光誘導視網(wǎng)膜變性豬模型的活體鑒定結(jié)果2.3.2.1 光誘導前后眼底視網(wǎng)膜照相的比較為了觀察光照前與光照后眼底有無異常表現(xiàn)，我們共對 7 頭豬 14 只眼全部進導前及光誘導后的同一部位的眼底照相�？梢姽庹T導后小型豬眼底照相圖片前眼底照相圖片相比，未見明顯的滲出、出血、萎縮等異常表現(xiàn)(圖 2-2.A，了視網(wǎng)膜無肉眼可見的損傷。

17圖 2-3.2 號豬左眼光誘導造模前后后極部視網(wǎng)膜 OCT 掃描誘導前視網(wǎng)膜圖像；B：光誘導 3M 后視網(wǎng)膜圖像。C.D：光照前后視網(wǎng)膜各層斷層L:脈絡膜血管層，RPE:色素上皮層，IS/OS:感光細胞內(nèi)外節(jié)帶，ONL：外核層， I GCL：節(jié)細胞層，NFL：神經(jīng)纖維層。肉眼可見造模后豬視網(wǎng)膜反射強度普遍降低狀層最明顯，IS/OS 和 RPE 反射帶間斷出現(xiàn)小的低反射區(qū)

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本文編號：2749881