【摘要】：目的： 用可見光誘導(dǎo)的方法建立廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性(Retinal Degeneration，RD)模型，探索活體對(duì)豬形態(tài)和功能學(xué)進(jìn)行檢測(cè)的方法并與離體組織學(xué)檢測(cè)手段一起對(duì)該模型進(jìn)行鑒定。然后，初步探索將人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinal Pigment Epithelium，RPE)移植到光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬視網(wǎng)膜下腔的手術(shù)方法，通過活體檢測(cè)方法觀察細(xì)胞移植術(shù)后的安全性、移植細(xì)胞和豬視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能學(xué)變化，為干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病最終進(jìn)入臨床奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.光誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性模型的建立與鑒定 采用白色熒光燈持續(xù)間斷光照豬3個(gè)月以上，誘導(dǎo)豬發(fā)生視網(wǎng)膜變性，運(yùn)用活體形態(tài)檢測(cè)方法-視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描(Optical Coherence Tomography，OCT)以及活體功能學(xué)檢測(cè)技術(shù)-全視野視網(wǎng)膜電圖(full-field Eletroretinography，fERG)和多焦視網(wǎng)膜電圖(multifocal Electroretinography，mfERG)，對(duì)豬視網(wǎng)膜進(jìn)行鑒定，并與視網(wǎng)膜組織切片HE染色和視網(wǎng)膜透射電鏡進(jìn)行比較分析。 2.初步探索光變性豬行hESC來源的RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植的手術(shù)方法、及光變性豬術(shù)后的活體形態(tài)和功能學(xué)檢測(cè) 探索改良hESC-RPE細(xì)胞懸液視網(wǎng)膜下腔移植的手術(shù)方法，在術(shù)后利用活體檢測(cè)方法如檢眼鏡、視網(wǎng)膜B超、視網(wǎng)膜OCT、fERG、mfERG、等手段觀察移植細(xì)胞在光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬視網(wǎng)膜下腔的存活、遷移、整合能力和術(shù)后豬視網(wǎng)膜功能的變化。 結(jié)果： 1.光誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬視網(wǎng)膜變性模型的建立與鑒定 與光照前相比，持續(xù)間斷光照2-4月齡小型豬3-6月后，視網(wǎng)膜OCT檢查可見光變性豬視網(wǎng)膜全層(內(nèi)界膜Inner Limiting Membrane至RPE層)厚度顯著變薄；fERG檢測(cè)發(fā)現(xiàn)光變性豬在暗適應(yīng)最大混合反應(yīng)的a、b波振幅和ops波振幅顯著下降，明適應(yīng)反應(yīng)的b波及p1波振幅也有顯著下降；mfERG檢測(cè)發(fā)現(xiàn)光變性豬視條紋區(qū)P1波平均振幅密度顯著降低。這都提示視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了明顯改變。視網(wǎng)膜OCT顯示的外核層(Outer nuclear layer，ONL)厚度與離體視網(wǎng)膜石蠟切片HE染色顯示的外核層厚度均明顯變薄，說明了視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生了損傷，活體OCT結(jié)果與離體組織檢測(cè)結(jié)果一致；視網(wǎng)膜透射電鏡發(fā)現(xiàn)感光細(xì)胞內(nèi)節(jié)線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡樣變，外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)破壞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)一步表明視網(wǎng)膜感光細(xì)胞發(fā)生了損傷，從超微結(jié)構(gòu)層面驗(yàn)證了活體檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。 2.光變性豬行hESC-RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植手術(shù)、及光變性豬術(shù)后的活體形態(tài)和功能學(xué)檢測(cè) 在本研究中，共對(duì)4頭光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬探索進(jìn)行了hESC-RPE細(xì)胞懸液視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)。第1批移植了1頭豬，在術(shù)后2周行檢眼鏡和視網(wǎng)膜B超檢查示并發(fā)性白內(nèi)障。換用手術(shù)顯微鏡及移植器械、改變手術(shù)方法后在第2批移植了3頭豬；術(shù)后2周行檢眼鏡、B超檢查示無白內(nèi)障、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥出現(xiàn)；術(shù)后1月時(shí)的視網(wǎng)膜OCT檢查示hESC-RPE細(xì)胞進(jìn)入光變性豬視網(wǎng)膜下腔，移植細(xì)胞能夠存活，未見排斥反應(yīng)；術(shù)后1月的fERG檢查示視網(wǎng)膜整體功能無明顯變化；術(shù)后1月mfERG檢查示0號(hào)豬移植區(qū)平均振幅密度高于對(duì)側(cè)偽手術(shù)眼，1號(hào)豬移植區(qū)平均振幅密度與對(duì)側(cè)偽手術(shù)眼無明顯差異，2號(hào)豬移植區(qū)平均振幅密度高于對(duì)側(cè)未手術(shù)眼。 結(jié)論： 1.與光照前相比，可見光光照廣西巴馬小型豬3個(gè)月以上，通過活體形態(tài)學(xué)檢測(cè)(OCT)、功能學(xué)(fERG、mfERG)檢測(cè)和離體組織學(xué)檢測(cè)(石蠟切片、透射電鏡)發(fā)現(xiàn)豬視網(wǎng)膜形態(tài)和功能均有顯著變化，表明光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性小型豬模型建立成功。 2.構(gòu)建了活體對(duì)大動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)和功能學(xué)檢測(cè)的平臺(tái)，通過對(duì)比活體OCT與離體組織切片對(duì)光變性豬進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，均提示外核層變薄，說明活體OCT與離體組織學(xué)結(jié)果一致，利用活體OCT對(duì)組織學(xué)進(jìn)行觀測(cè)具有可靠性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)活體OCT對(duì)光變性豬的形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果與活體fERG和mfERG的功能學(xué)檢測(cè)結(jié)果是一致的，表明其具有一定的相關(guān)性。 3.探索建立了hESC-RPE細(xì)胞懸液移植到豬視網(wǎng)膜下腔的手術(shù)方法，改進(jìn)手術(shù)設(shè)備和方法后的3頭豬移植術(shù)后早期無并發(fā)癥發(fā)生，安全性較好。 4.光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬行hESC-RPE細(xì)胞視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)后1月時(shí),活體形態(tài)學(xué)檢測(cè)(OCT)顯示移植細(xì)胞在變性豬視網(wǎng)膜下腔存活，無明顯的排斥反應(yīng)發(fā)生；活體功能學(xué)(fERG、mfERG)檢測(cè)顯示hESC-RPE視網(wǎng)膜下腔移植術(shù)后早期對(duì)豬視網(wǎng)膜整體功能無明顯影響，但是在移植區(qū)局部有2頭豬出現(xiàn)多焦視網(wǎng)膜功能的提高。表明手術(shù)對(duì)光變性豬視網(wǎng)膜整體功能無明顯影響，hESC-RPE細(xì)胞移植可能會(huì)改善移植區(qū)局部視網(wǎng)膜功能。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.13;R-332
【圖文】：

圖 2-1 小型豬及光誘導(dǎo)造模室概況A：廣西巴馬小型豬；B：光誘導(dǎo)造模室(溫度 10-25℃，光強(qiáng) 2500lux)2.3.2 .光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬模型的活體鑒定結(jié)果2.3.2.1 光誘導(dǎo)前后眼底視網(wǎng)膜照相的比較為了觀察光照前與光照后眼底有無異常表現(xiàn)，我們共對(duì) 7 頭豬 14 只眼全部光誘導(dǎo)前及光誘導(dǎo)后的同一部位的眼底照相。可見光誘導(dǎo)后小型豬眼底照相圖誘導(dǎo)前眼底照相圖片相比，未見明顯的滲出、出血、萎縮等異常表現(xiàn)(圖 2-2.A說明了視網(wǎng)膜無肉眼可見的損傷。

圖 2-1 小型豬及光誘導(dǎo)造模室概況A：廣西巴馬小型豬；B：光誘導(dǎo)造模室(溫度 10-25℃，光強(qiáng) 2500lux)2.3.2 .光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜變性豬模型的活體鑒定結(jié)果2.3.2.1 光誘導(dǎo)前后眼底視網(wǎng)膜照相的比較為了觀察光照前與光照后眼底有無異常表現(xiàn)，我們共對(duì) 7 頭豬 14 只眼全部進(jìn)導(dǎo)前及光誘導(dǎo)后的同一部位的眼底照相�？梢姽庹T導(dǎo)后小型豬眼底照相圖片前眼底照相圖片相比，未見明顯的滲出、出血、萎縮等異常表現(xiàn)(圖 2-2.A，了視網(wǎng)膜無肉眼可見的損傷。

17圖 2-3.2 號(hào)豬左眼光誘導(dǎo)造模前后后極部視網(wǎng)膜 OCT 掃描誘導(dǎo)前視網(wǎng)膜圖像；B：光誘導(dǎo) 3M 后視網(wǎng)膜圖像。C.D：光照前后視網(wǎng)膜各層斷層L:脈絡(luò)膜血管層，RPE:色素上皮層，IS/OS:感光細(xì)胞內(nèi)外節(jié)帶，ONL：外核層， I GCL：節(jié)細(xì)胞層，NFL：神經(jīng)纖維層。肉眼可見造模后豬視網(wǎng)膜反射強(qiáng)度普遍降低狀層最明顯，IS/OS 和 RPE 反射帶間斷出現(xiàn)小的低反射區(qū)

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