【摘要】：第一部分:miR-184在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的表達(dá)和作用目的:檢測(cè)miR-184在正常視網(wǎng)膜組織與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(RB)組織中的表達(dá)差異,并通過(guò)合成miR-184抑制劑和模擬劑檢測(cè)miR-184對(duì)RB細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲和遷移的影響。方法:利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)5名手術(shù)患者RB組織與正常視網(wǎng)膜組織、RB細(xì)胞系中(Y79細(xì)胞和WERI-RB-1細(xì)胞)miR-184表達(dá)差異,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對(duì)比正常視網(wǎng)膜組織與RB組織中的表達(dá)差異;參考國(guó)內(nèi)外對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)方法,通過(guò)將WERI-RB-1細(xì)胞復(fù)蘇、傳代將狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期WERI-RB-1細(xì)胞分為六組:正常對(duì)照組、空白脂質(zhì)體對(duì)照組、miR-184 mimic NC 組、miR-184 mimic 組、miR-184 inhibitor NC 組和 miR-184 inhibitor組。然后將miR-184模擬劑和miR-184抑制劑分別轉(zhuǎn)染到miR-184 mimic組、miR-184 inhibitor組中,應(yīng)用Trizol法提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-184的表達(dá),驗(yàn)證miR-184模擬劑和抑制劑對(duì)miR-184的表達(dá)差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以檢驗(yàn)miR-184模擬劑和抑制劑的有效性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將人RB細(xì)胞株WERI-RB-1細(xì)胞分為分為六組:正常對(duì)照組、空白脂質(zhì)體對(duì)照組、miR-184 mimics NC組、miR-184 mimics組、miR-184 inhibitor NC組和miR-184 inhibitor組,CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞增殖抑制率,AnnexinV和7-AAD染色并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期,Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移。通過(guò)單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)。結(jié)果:通過(guò)對(duì)比正常視網(wǎng)膜組織、RB細(xì)胞系和RB組織之間的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn):與正常組織相比,miR-184在RB細(xì)胞(Y79細(xì)胞和WERI-RB-1細(xì)胞)和RB組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-184模擬劑和抑制劑可分別上調(diào)(p0.05)和下調(diào)(p0.05)miR-184的表達(dá)(p0.05)。CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖證實(shí):與陰性空白對(duì)照組(0%)、脂質(zhì)體對(duì)照組(0.25%)、miR184mimicNC對(duì)照組(2.57%)相比,miR184mimic轉(zhuǎn)染組(23.69%)對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞增殖的抑制率明顯提高,miR184 inhibitor顯著促進(jìn)WERI-RB-1細(xì)胞增殖(-12.61%),差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),而陰性空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、miR184 mimicNC對(duì)照組之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。通過(guò)PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn):miR-184mimic處理后RB細(xì)胞G0/G1期比例顯著增加,S期比例顯著降低,而G2/M期比例無(wú)顯著改變,miR-184可將RB細(xì)胞周期阻滯于G1期(p0.01)。凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-184主要誘導(dǎo)RB細(xì)胞早期凋亡,對(duì)晚期凋亡和壞死影響不明顯。miR-184 mimic組早期調(diào)亡陽(yáng)性率為17.25%,明顯高于空白對(duì)照組(6.50%)、空脂質(zhì)體組(7.37%)、miR-184 mimic NC 對(duì)照組(7.37%)、miR-184 inhibitor NC 對(duì)照組(6.62%),而 miR184 inhibitor 轉(zhuǎn)染組則顯著降低(3.40%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),空脂質(zhì)體組、陰性miRNA對(duì)照組與空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞的侵襲與遷移也具有顯著的抑制作用。結(jié)論:miR-184在RB組織及細(xì)胞中較在正常視網(wǎng)膜組織中下調(diào)。建立了miR-184模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染的WERI-RB-1細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)模型,并證實(shí)miR-184能抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-RB-1細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖,誘導(dǎo)RB細(xì)胞凋亡。miR-184可能是RB治療的潛在手段。第二部分:miR-184通過(guò)靶向SLC7A5調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為研究目的:研究miR-184調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的機(jī)制,并驗(yàn)證miR-184與SLC7A5表達(dá)的關(guān)系。方法:多種miRNA靶向數(shù)據(jù)庫(kù)搜索miR-184靶向調(diào)控基因,韋恩圖交叉分析篩選miR-184潛在調(diào)控基因;用qRT-PCR和western blotting法檢測(cè)miR-184抑制劑和模擬劑處理后潛在基因mRNA的表達(dá)差異,進(jìn)而明確miR-184影響最明顯的潛在基因。培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株WERI-RB-1后,將實(shí)驗(yàn)對(duì)象為分為六組:正常對(duì)照組、空白脂質(zhì)體對(duì)照組、miR-184 mimicsNC組、miR-184 mimics 組、miR-184 inhibitor NC 組和 miR-184 inhibitor 組。qRT-PCR 分析SLC7A5的mRNA的水平;Western blotting檢測(cè)SLC7A5蛋白的表達(dá)水平。構(gòu)建pMIR-REPORT-SLC7A5 3-UTR熒光素酶質(zhì)粒。熒光素酶活性檢測(cè)法檢測(cè)miR-184和野生型SLC7A5R3-UTR與靶位點(diǎn)單獨(dú)突變(Mut1、Mut2、Mut3)之間的相互作用,各組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。構(gòu)建SLC7A5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcMV6-SLC7A5),分組為:miR-184 mimic NC、miR-184 mimic、miR184 mimic+pcMV6、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5,檢測(cè) miR-184 靶向 SLC7A5 對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結(jié)果:通過(guò)多種miRNA靶向基因數(shù)據(jù)庫(kù)交叉分析篩選出miR-184潛在調(diào)控的2個(gè)基因:TNP02和SLC7A5,其中miR-184與SLC7A5有三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。miR-184對(duì)SLC7A5和TNP02 mRNA表達(dá)均有抑制作用,且對(duì)SLC7A5的抑制作用更明顯(p0.05 =;熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR184主要通過(guò)靶向SLC7A5 mRNA 3'UTR區(qū)2494-2513區(qū)域下調(diào)SLC7A5 mRNA和蛋白表達(dá)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示不同分組細(xì)胞增殖的抑制率分別為:miR-184 mimicNC(2.1%)、miR-184 mimic(16.2%)、miR184mimic+pcMV6(14.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(2.4%),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞的增殖抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示不同分組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為:miR-184 mimic NC(7.8%)、miR-184 mimic(17.3%)、miR184 mimic+pcMV6(16.9%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(8.2%),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞凋亡促進(jìn)的作用,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);與miR-184 mimic NC組相比,Transwell實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞遷移百分?jǐn)?shù)分別為:miR-184 mimic(57.9%)、miR-184 mimic+pcMV6(61.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(95.6%),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞的遷移能力的抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);細(xì)胞侵襲百分率分別為:miR-184 mimic(27.3%)、miR184 mimic+pcMV6(33.3%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(93.1%),結(jié)果顯示過(guò)表達(dá) SLC7A5 蛋白能拮抗 miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞遷移的抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:SLC7A5蛋白能促進(jìn)WERI-RB-1細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用,并能促進(jìn)WERI-RB-1細(xì)胞的侵襲和遷移能力。與miR-184作用相反,SLC7A5蛋白能拮抗miR-184對(duì)WERI-RB-1細(xì)胞的遷、侵襲和增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)移作用。結(jié)合熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明miR-184可通過(guò)靶向SLC7A5對(duì)RB發(fā)揮抑制作用。第三部分土家族中一個(gè)先天性無(wú)虹膜家系的臨床特點(diǎn)和PAX6基因突變位點(diǎn)分析目的:確認(rèn)土家族中一個(gè)先天性無(wú)虹膜家系的PAX6基因致病突變并分析其臨床特點(diǎn)。方法:對(duì)該家系中所有成員7人進(jìn)行詳細(xì)的眼部檢查,采集所有家系成員及100名(50例土家族50例漢族)正常對(duì)照組的外周靜脈血,提取DNA;對(duì)先證者PAX6基因的全部外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序;對(duì)家系中所有成員和正常對(duì)照組進(jìn)行PAX6基因突變位點(diǎn)的驗(yàn)證檢測(cè)。結(jié)果:該家系主要以虹膜缺損、白內(nèi)障、眼球震顫、黃斑中心凹發(fā)育不良和角膜炎為主要臨床表現(xiàn),虹膜缺損輕重不一,角膜炎和白內(nèi)障情況隨年齡增加而加重;該家系中1男3女共4例患者均在第外顯子3與內(nèi)含子3交界處出現(xiàn)一個(gè)雜合突變(c.357+1GA),正常成員及對(duì)照組均無(wú)此突變。結(jié)論:該家系臨床表現(xiàn)大體一致,虹膜缺損程度不一;PAX6是該家系的致病基因,(c.357+1GA)突變?cè)谖覈?guó)土家族中未曾報(bào)道。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.7;R773.1
【圖文】：

對(duì)照組（Ｎｔ，邋Ｎ２）視網(wǎng)膜組織中ｍｉＲ－１８４的表達(dá)差明顯。ＲＢ患者（Ｐｉ－Ｐｓ）與健逡逑康對(duì)照組（凡，Ｎ２）相比ｍｉＲ－１８４的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜逡逑０．０５）（圖１Ａ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ法檢測(cè)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）與逡逑正常視網(wǎng)膜細(xì)胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）中ｍｉＲ－１８４的表達(dá)差異。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜母細(xì)逡逑胞瘤細(xì)胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）與正常視網(wǎng)膜細(xì)胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）相比ｍｉＲ－１８４逡逑的表達(dá)明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０５＝（圖ＩＢ）逡逑Ｐ：（ＲＢ邋ｔｉｓｓｕｆｔｓ）逡逑Ｎｒｉｒｃｄｎａｔ邋ｉｓｓｕｅｓ）逡逑Ａ邐邐Ｂ逡逑４．０－

達(dá)的成熟ｍｉＲ－１８４相比對(duì)照組顯著增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０５）。逡逑而陰性空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、ｍｉＲ－１８４邋ｍｉｍｉｃｓ邋ＮＣ對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)意義（ｐ＞0．0５）（圖２Ａ，２Ｃ）。而ｍｉＲ－１８４抑制劑則顯著降低ＷＥＲＩ－ＲＢ－１逡逑細(xì)胞ｍｉＲ－１８４的表達(dá)：通過(guò)與陰性空白對(duì)照組（１．００±０．０１）、脂質(zhì)體對(duì)照組逡逑（１．２１±０．３８）、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ邋對(duì)照組（１．２２±０．２４）相比，ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑轉(zhuǎn)染組（０．５９±０．１８）所表達(dá)的成熟ｍｉＲ－１８４相比對(duì)照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)逡逑計(jì)學(xué)意義（ｐ＜0．0５），陰性空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ逡逑對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＞0．0５）（圖２Ｂ，邋２Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ邋ｉ．５ｌ邐Ｃ邋１0１邐甲逡逑Ｉ：邋ｒｉｌｒｌｉｌｉｌｌ邋：逡逑！２邋°ｉｌ邋Ｈｉｉ邋１１邋＿［逡逑圖２邋Ａ：各組ＷＥＲＪ－ＲＢ－ｌ細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬劑４８ｈ后成熟ｍｉＲ－１８４表達(dá)情況。Ｂ：ｑＲＴ－ＰＣＲ法驗(yàn)證逡逑ＷＥＲＩ－ＲＢ－１邋細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬劑邋ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋４８ｈ邋后，成熟邋ｍｉＲ－１８４邋表達(dá)情況。Ｃ：邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋法逡逑驗(yàn)證ＷＥＲＩ－ＲＢ－１細(xì)胞轉(zhuǎn)染模擬劑與抑制劑４８ｈ后ｍｉＲ－１８４表達(dá)綜合對(duì)比逡逑３．３邋ＣＣＫ８法驗(yàn)證ｍｉＲ－１８４模擬劑和抑制劑對(duì)ＷＥＲＩ－ＲＢ－１細(xì)胞X椫車膩義嫌跋戾義銜徊矯魅罰恚椋遙保福炊裕遙孿赴撓跋

本文編號(hào)：2749210