【摘要】：第一部分:miR-184在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的表達和作用目的:檢測miR-184在正常視網(wǎng)膜組織與視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)組織中的表達差異,并通過合成miR-184抑制劑和模擬劑檢測miR-184對RB細胞增殖、凋亡、細胞周期、細胞侵襲和遷移的影響。方法:利用實時熒光定量PCR方法檢測5名手術(shù)患者RB組織與正常視網(wǎng)膜組織、RB細胞系中(Y79細胞和WERI-RB-1細胞)miR-184表達差異,應(yīng)用統(tǒng)計學分析,對比正常視網(wǎng)膜組織與RB組織中的表達差異;參考國內(nèi)外對WERI-RB-1細胞的復蘇培養(yǎng)方法,通過將WERI-RB-1細胞復蘇、傳代將狀態(tài)良好的對數(shù)生長期WERI-RB-1細胞分為六組:正常對照組、空白脂質(zhì)體對照組、miR-184 mimic NC 組、miR-184 mimic 組、miR-184 inhibitor NC 組和 miR-184 inhibitor組。然后將miR-184模擬劑和miR-184抑制劑分別轉(zhuǎn)染到miR-184 mimic組、miR-184 inhibitor組中,應(yīng)用Trizol法提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測miR-184的表達,驗證miR-184模擬劑和抑制劑對miR-184的表達差異是否有統(tǒng)計學意義,以檢驗miR-184模擬劑和抑制劑的有效性,實驗重復三次。將人RB細胞株WERI-RB-1細胞分為分為六組:正常對照組、空白脂質(zhì)體對照組、miR-184 mimics NC組、miR-184 mimics組、miR-184 inhibitor NC組和miR-184 inhibitor組,CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染48h后的細胞增殖抑制率,AnnexinV和7-AAD染色并用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和細胞周期,Transwell法檢測細胞的侵襲和遷移。通過單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)。結(jié)果:通過對比正常視網(wǎng)膜組織、RB細胞系和RB組織之間的表達差異發(fā)現(xiàn):與正常組織相比,miR-184在RB細胞(Y79細胞和WERI-RB-1細胞)和RB組織中的表達顯著下調(diào)。通過轉(zhuǎn)染實驗證實miR-184模擬劑和抑制劑可分別上調(diào)(p0.05)和下調(diào)(p0.05)miR-184的表達(p0.05)。CCK8檢測細胞增殖證實:與陰性空白對照組(0%)、脂質(zhì)體對照組(0.25%)、miR184mimicNC對照組(2.57%)相比,miR184mimic轉(zhuǎn)染組(23.69%)對WERI-RB-1細胞增殖的抑制率明顯提高,miR184 inhibitor顯著促進WERI-RB-1細胞增殖(-12.61%),差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01),而陰性空白對照組、脂質(zhì)體對照組、miR184 mimicNC對照組之間差異并無統(tǒng)計學意義(p0.05)。通過PI染色檢測細胞周期發(fā)現(xiàn):miR-184mimic處理后RB細胞G0/G1期比例顯著增加,S期比例顯著降低,而G2/M期比例無顯著改變,miR-184可將RB細胞周期阻滯于G1期(p0.01)。凋亡檢測發(fā)現(xiàn),miR-184主要誘導RB細胞早期凋亡,對晚期凋亡和壞死影響不明顯。miR-184 mimic組早期調(diào)亡陽性率為17.25%,明顯高于空白對照組(6.50%)、空脂質(zhì)體組(7.37%)、miR-184 mimic NC 對照組(7.37%)、miR-184 inhibitor NC 對照組(6.62%),而 miR184 inhibitor 轉(zhuǎn)染組則顯著降低(3.40%),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),空脂質(zhì)體組、陰性miRNA對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Transwell實驗證實miR-184對WERI-RB-1細胞的侵襲與遷移也具有顯著的抑制作用。結(jié)論:miR-184在RB組織及細胞中較在正常視網(wǎng)膜組織中下調(diào)。建立了miR-184模擬劑和抑制劑轉(zhuǎn)染的WERI-RB-1細胞瞬時表達模型,并證實miR-184能抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤WERI-RB-1細胞的遷移、侵襲和增殖,誘導RB細胞凋亡。miR-184可能是RB治療的潛在手段。第二部分:miR-184通過靶向SLC7A5調(diào)控視網(wǎng)膜母細胞瘤生物學行為研究目的:研究miR-184調(diào)控視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的機制,并驗證miR-184與SLC7A5表達的關(guān)系。方法:多種miRNA靶向數(shù)據(jù)庫搜索miR-184靶向調(diào)控基因,韋恩圖交叉分析篩選miR-184潛在調(diào)控基因;用qRT-PCR和western blotting法檢測miR-184抑制劑和模擬劑處理后潛在基因mRNA的表達差異,進而明確miR-184影響最明顯的潛在基因。培養(yǎng)人視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞株WERI-RB-1后,將實驗對象為分為六組:正常對照組、空白脂質(zhì)體對照組、miR-184 mimicsNC組、miR-184 mimics 組、miR-184 inhibitor NC 組和 miR-184 inhibitor 組。qRT-PCR 分析SLC7A5的mRNA的水平;Western blotting檢測SLC7A5蛋白的表達水平。構(gòu)建pMIR-REPORT-SLC7A5 3-UTR熒光素酶質(zhì)粒。熒光素酶活性檢測法檢測miR-184和野生型SLC7A5R3-UTR與靶位點單獨突變(Mut1、Mut2、Mut3)之間的相互作用,各組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。構(gòu)建SLC7A5過表達質(zhì)粒(pcMV6-SLC7A5),分組為:miR-184 mimic NC、miR-184 mimic、miR184 mimic+pcMV6、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5,檢測 miR-184 靶向 SLC7A5 對WERI-RB-1細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響。結(jié)果:通過多種miRNA靶向基因數(shù)據(jù)庫交叉分析篩選出miR-184潛在調(diào)控的2個基因:TNP02和SLC7A5,其中miR-184與SLC7A5有三個識別位點。miR-184對SLC7A5和TNP02 mRNA表達均有抑制作用,且對SLC7A5的抑制作用更明顯(p0.05 =;熒光素酶實驗證實miR184主要通過靶向SLC7A5 mRNA 3'UTR區(qū)2494-2513區(qū)域下調(diào)SLC7A5 mRNA和蛋白表達。細胞增殖實驗顯示不同分組細胞增殖的抑制率分別為:miR-184 mimicNC(2.1%)、miR-184 mimic(16.2%)、miR184mimic+pcMV6(14.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(2.4%),結(jié)果顯示過表達SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對WERI-RB-1細胞的增殖抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01);細胞凋亡實驗顯示不同分組細胞的細胞凋亡率分別為:miR-184 mimic NC(7.8%)、miR-184 mimic(17.3%)、miR184 mimic+pcMV6(16.9%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(8.2%),結(jié)果顯示過表達SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對WERI-RB-1細胞凋亡促進的作用,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01);與miR-184 mimic NC組相比,Transwell實驗顯示細胞遷移百分數(shù)分別為:miR-184 mimic(57.9%)、miR-184 mimic+pcMV6(61.8%)、miR184mimic+pcMV6-SLC7A5(95.6%),結(jié)果顯示過表達SLC7A5蛋白后能拮抗miR-184對WERI-RB-1細胞的遷移能力的抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01);細胞侵襲百分率分別為:miR-184 mimic(27.3%)、miR184 mimic+pcMV6(33.3%)、miR184 mimic+pcMV6-SLC7A5(93.1%),結(jié)果顯示過表達 SLC7A5 蛋白能拮抗 miR-184對WERI-RB-1細胞遷移的抑制作用,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(p0.01)。結(jié)論:SLC7A5蛋白能促進WERI-RB-1細胞的增殖和抑制細胞凋亡的作用,并能促進WERI-RB-1細胞的侵襲和遷移能力。與miR-184作用相反,SLC7A5蛋白能拮抗miR-184對WERI-RB-1細胞的遷、侵襲和增殖的抑制和凋亡的促進移作用。結(jié)合熒光素酶實驗證明miR-184可通過靶向SLC7A5對RB發(fā)揮抑制作用。第三部分土家族中一個先天性無虹膜家系的臨床特點和PAX6基因突變位點分析目的:確認土家族中一個先天性無虹膜家系的PAX6基因致病突變并分析其臨床特點。方法:對該家系中所有成員7人進行詳細的眼部檢查,采集所有家系成員及100名(50例土家族50例漢族)正常對照組的外周靜脈血,提取DNA;對先證者PAX6基因的全部外顯子進行PCR擴增及測序;對家系中所有成員和正常對照組進行PAX6基因突變位點的驗證檢測。結(jié)果:該家系主要以虹膜缺損、白內(nèi)障、眼球震顫、黃斑中心凹發(fā)育不良和角膜炎為主要臨床表現(xiàn),虹膜缺損輕重不一,角膜炎和白內(nèi)障情況隨年齡增加而加重;該家系中1男3女共4例患者均在第外顯子3與內(nèi)含子3交界處出現(xiàn)一個雜合突變(c.357+1GA),正常成員及對照組均無此突變。結(jié)論:該家系臨床表現(xiàn)大體一致,虹膜缺損程度不一;PAX6是該家系的致病基因,(c.357+1GA)突變在我國土家族中未曾報道。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.7;R773.1
【圖文】：

對照組（Ｎｔ，邋Ｎ２）視網(wǎng)膜組織中ｍｉＲ－１８４的表達差明顯。ＲＢ患者（Ｐｉ－Ｐｓ）與健逡逑康對照組（凡，Ｎ２）相比ｍｉＲ－１８４的表達明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜逡逑０．０５）（圖１Ａ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ法檢測視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）與逡逑正常視網(wǎng)膜細胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）中ｍｉＲ－１８４的表達差異。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜母細逡逑胞瘤細胞系（Ｙ７９，ＷＥＲＩ－ＲＢ－１）與正常視網(wǎng)膜細胞（ｎｏｒｍａｌ邋ｒｅｔｉｎａｌ）相比ｍｉＲ－１８４逡逑的表達明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜０．０５＝（圖ＩＢ）逡逑Ｐ：（ＲＢ邋ｔｉｓｓｕｆｔｓ）逡逑Ｎｒｉｒｃｄｎａｔ邋ｉｓｓｕｅｓ）逡逑Ａ邐邐Ｂ逡逑４．０－

達的成熟ｍｉＲ－１８４相比對照組顯著增加，且差異具有統(tǒng)計學意義（ｐ＜０．０５）。逡逑而陰性空白對照組、脂質(zhì)體對照組、ｍｉＲ－１８４邋ｍｉｍｉｃｓ邋ＮＣ對照組之間差異無統(tǒng)計逡逑學意義（ｐ＞0．0５）（圖２Ａ，２Ｃ）。而ｍｉＲ－１８４抑制劑則顯著降低ＷＥＲＩ－ＲＢ－１逡逑細胞ｍｉＲ－１８４的表達：通過與陰性空白對照組（１．００±０．０１）、脂質(zhì)體對照組逡逑（１．２１±０．３８）、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ邋對照組（１．２２±０．２４）相比，ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑轉(zhuǎn)染組（０．５９±０．１８）所表達的成熟ｍｉＲ－１８４相比對照組顯著降低，且差異具有統(tǒng)逡逑計學意義（ｐ＜0．0５），陰性空白對照組、脂質(zhì)體對照組、ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ逡逑對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（ｐ＞0．0５）（圖２Ｂ，邋２Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ邋ｉ．５ｌ邐Ｃ邋１0１邐甲逡逑Ｉ：邋ｒｉｌｒｌｉｌｉｌｌ邋：逡逑�。插�°ｉｌ邋Ｈｉｉ邋１１邋＿［逡逑圖２邋Ａ：各組ＷＥＲＪ－ＲＢ－ｌ細胞轉(zhuǎn)染模擬劑４８ｈ后成熟ｍｉＲ－１８４表達情況。Ｂ：ｑＲＴ－ＰＣＲ法驗證逡逑ＷＥＲＩ－ＲＢ－１邋細胞轉(zhuǎn)染模擬劑邋ｍｉＲ－１８４邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋４８ｈ邋后，成熟邋ｍｉＲ－１８４邋表達情況。Ｃ：邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋法逡逑驗證ＷＥＲＩ－ＲＢ－１細胞轉(zhuǎn)染模擬劑與抑制劑４８ｈ后ｍｉＲ－１８４表達綜合對比逡逑３．３邋ＣＣＫ８法驗證ｍｉＲ－１８４模擬劑和抑制劑對ＷＥＲＩ－ＲＢ－１細胞X椫車膩義嫌跋戾義銜徊矯魅罰恚椋遙保福炊裕遙孿赴撓跋

本文編號：2749210