【摘要】：角膜是眼球最前部的突出部分,直接與外界環(huán)境相接,因而容易遭受外界的損傷。人眼角膜共分5層,角膜上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層。角膜上皮是最外層,發(fā)生機(jī)械性及化學(xué)性損傷的概率較高,損傷后可引起畏光流淚等癥狀,直接影響到患者的正常生活。采用藥物治療時,眼藥水的滲透性增加,其含有的添加劑、防腐劑會加重藥物的毒副作用,易導(dǎo)致角膜基質(zhì)的溶解、繼發(fā)感染;甚至穿孑L,因此角膜上皮缺損后,能否迅速完整地促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,恢復(fù)角膜上皮細(xì)胞的屏障功能,是保持良好視力的關(guān)鍵。所以選擇迅速有效促進(jìn)角膜上皮再生的方法,對于角膜上皮機(jī)械性及化學(xué)性損傷的恢復(fù)具有重要的作用。 角膜內(nèi)皮層在維持角膜的正常生理功能方面起著重要作用。人角膜內(nèi)皮細(xì)胞在成年后幾乎不進(jìn)行有絲分裂,細(xì)胞密度隨著年齡的增長逐漸減少,且角膜內(nèi)皮對許多外界因素極為敏感,機(jī)械性創(chuàng)傷、化學(xué)品、藥物和物理射線、眼科疾病等均能導(dǎo)致角膜內(nèi)皮損傷。損傷后,角膜內(nèi)皮細(xì)胞主要依靠鄰近細(xì)胞擴(kuò)張、移行來填補(bǔ)缺損區(qū)。當(dāng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度小于臨界細(xì)胞密度(400~500+/mm。)時,殘存的內(nèi)皮不能代償,可導(dǎo)致角膜基質(zhì)層水腫,角膜透明度下降,甚至致盲。角膜移植是目前恢復(fù)角膜透明性的主要治療方法,但是同種異體角膜移植供體來源匱乏,還常伴有一定的免疫排斥反應(yīng),因此角膜內(nèi)皮病的治療是國際上的一項難題。 隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,應(yīng)用組織工程化方法治療角膜疾病成為研究的一個熱點。殼聚糖是一種天然聚陽離子多糖,在醫(yī)藥、生物材料、食品、日用化工、生物工程和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有較為廣泛的研究和應(yīng)用。殼聚糖具有可生物降解性、成膜性、成膠性、可促進(jìn)傷口愈合等性質(zhì)和功能,己成為多糖生物材料研究的熱點之一。但是由于殼聚糖的水不溶性,以及降解過程中產(chǎn)生的顆粒物會伴隨著一定的炎癥反應(yīng),所以本研究以殼聚糖為基本材料,通過化學(xué)修飾改性旨在研究水溶性殼聚糖基生物材料在角膜損傷修復(fù)中的作用及應(yīng)用。 本研究共為兩部分:(一)首先制備了羥乙基殼聚糖(Hydroxyethyl chitosan, HECTS),對其基本性質(zhì)進(jìn)行了研究;并將其與明膠(Gelatin,Gel)和硫酸軟骨素(chondroitin Sulfate,Cs)按照一定比例共混,制備了殼聚糖基共混膜片,對該膜片的理化性質(zhì)、細(xì)胞毒性、與角膜細(xì)胞的相容性、體外和體內(nèi)的降解性等進(jìn)行了研究,篩選出性質(zhì)優(yōu)異的膜片;將培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞接種于篩選出的殼聚糖基共混膜片上,構(gòu)建了組織工程角膜上皮,移植在機(jī)械損傷角膜上皮層的新西蘭兔動物模型上,觀察其修復(fù)效果。(二)制備羥丙基殼聚糖(}tydroxypropyl Chitosan,HP(:TS)一透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)復(fù)合水凝膠,對該水凝膠的細(xì)胞毒性、體內(nèi)生物相容性和兔眼前房生物降解性等進(jìn)行了評價;以該水凝膠為載體,包載體外培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植在去除角膜內(nèi)皮層的兔眼后彈力層上,觀察對角膜內(nèi)皮損傷模型的修復(fù)效果。 得到以下實驗結(jié)果: 1、本研究制備的羥乙基殼聚糖具有良好水溶性;細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明細(xì)胞毒性O(shè).1級,屬于無毒的生物材料;在一定濃度下對角膜上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的生長具有明顯的促進(jìn)作用。 2、將HECTs與cs和Gel按不同質(zhì)量比例進(jìn)行優(yōu)化,制得共混膜片,具有高透明性,且1#的透明性比2#還要高,對’Nacl和葡萄糖均具有良好的通透性;細(xì)胞毒性符合生物醫(yī)用材料的標(biāo)準(zhǔn);基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞都能在膜片上生長且形成良好的單層,膜片經(jīng)大鼠肌肉內(nèi)植入試驗以評價材料的生物相容性和生物降解性,結(jié)果表明,膜片在肌肉內(nèi)穩(wěn)定降解且不產(chǎn)生“包囊”現(xiàn)象,與不可降解的手術(shù)縫合線相比較,產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)較輕:將共混膜片植入兔眼前房內(nèi),發(fā)現(xiàn)膜片能夠緩慢地降解且不產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng),為下一步組織工程化角膜的體外構(gòu)建及移植實驗的繼續(xù)深入研究提供了良好的實驗依據(jù)。 3、將體外培養(yǎng)了角膜上皮細(xì)胞接種于共混膜上,上皮細(xì)胞能夠在膜片上貼附生長并彼此連接成片層,細(xì)胞狀態(tài)良好;將載有上皮細(xì)胞的共混膜片用于嚴(yán)重機(jī)械損傷的兔角膜上皮層上,結(jié)果表明實驗組的修復(fù)創(chuàng)面時間要比對照組縮短了一半,修復(fù)效果具有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、羥丙基殼聚糖與透明質(zhì)酸可以通過電荷作用形成多糖水凝膠,細(xì)胞毒性評價為O級;凝膠在肌肉組織中的降解性研究表明,早期出現(xiàn)一定的炎癥反應(yīng), 20d時隨著材料的大部分降解炎癥反應(yīng)明顯消退。 5、以多糖水凝膠為載體,將兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞固定化移植在已除去角膜內(nèi)皮層的異體兔眼后彈力層上,術(shù)后通過外眼像觀察、掃描電鏡、組織學(xué)觀察以及裂隙燈觀察均得出一致的結(jié)果,即75d時觀察到實驗組已形成了良好的角膜內(nèi)皮層,角膜薄而透明,移植上的角膜內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)良好與正常兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞基本保持一致,90d時,實驗組兔眼已基本恢復(fù)正常;損傷對照組角膜厚而混濁,裂隙燈觀察角膜仍保持混濁不透明,說明本實驗建立的內(nèi)皮損傷模型很成功,采用的凝膠包載角膜內(nèi)皮細(xì)胞行角膜內(nèi)皮層的原位修復(fù)方法有效。 總之,本文研究的殼聚糖基生物材料作為細(xì)胞載體,對兔角膜上皮機(jī)械損傷和角膜內(nèi)皮層損傷的原位修復(fù)具有明顯的治療效果,為今后角膜組織工程方法治療角膜疾病的研究提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R318.08;R772.2

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本文編號：2741412