【摘要】：研究背景慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis,CRS),是耳鼻喉科的最常見的疾病之一,一般指持續(xù)超過12周的鼻腔與鼻竇粘膜的慢性炎癥。多中心統(tǒng)計(jì)研究表明不同國家的CRS發(fā)病率均有逐年增加的趨勢。CRS雖然不是致命性疾病,卻導(dǎo)致病人很多功能、記憶及感情方面的損害。隨著鼻用藥物及功能性內(nèi)鏡鼻竇手術(shù)的發(fā)展,CRS的診療水平有了很大的進(jìn)步,但是臨床工作中仍發(fā)現(xiàn)很多復(fù)發(fā)的病人。這類病人即使經(jīng)規(guī)范的藥物治療及多次鼻內(nèi)鏡翻修手術(shù),治療效果仍不盡如人意,這可能與CRS的復(fù)雜的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制尚不清除有關(guān)。目前認(rèn)為致病的主要因素有:細(xì)菌、病毒感染;鼻腔解剖結(jié)構(gòu)異常;上皮細(xì)胞功能障礙;變態(tài)反應(yīng)及免疫功能下降等,其中細(xì)菌感染是CRS公認(rèn)的重要致病因素之一。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)為革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁外膜的重要組成部分,能激活單核-巨噬細(xì)胞胞,炎癥細(xì)胞大量浸潤,釋放白介素、腫瘤壞死因子等活性物質(zhì),引起炎癥反應(yīng)。鼻腔粘膜的上皮細(xì)胞是一道天然的屏障,具有活躍的分泌功能,在外界理化因素的刺激下,釋放細(xì)胞因子作用于其他細(xì)胞,在鼻腔、鼻竇的慢性炎癥、損傷修復(fù)及重塑過程中起著重要作用。細(xì)胞自噬(Autophagy)是真核生物細(xì)胞中維持細(xì)胞生存,緩解細(xì)胞內(nèi)外壓力的重要代謝過程。細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境壓力變化下,形成一種雙層膜的吞噬泡(phagophore),包裹細(xì)胞內(nèi)損壞的長周期蛋白、變性壞死的細(xì)胞器或入侵的病原體形成自噬體,然后在細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的作用下與溶酶體融合,在溶酶體酸性水解酶的作用下進(jìn)一步消化降解,為細(xì)胞的再循環(huán)提供原料和能量。然而,在一定條件下,自噬溶酶體過量降解了正常的細(xì)胞器和長周期蛋白導(dǎo)致細(xì)胞主動(dòng)性死亡,即細(xì)胞自噬死亡(Autophagic cell death)。細(xì)胞自噬是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)連續(xù)的過程,自噬在不同疾病甚至在同一疾病的不同階段扮演著不同的角色。研究表明,有30多種分子組成不同的信號(hào)通路調(diào)控自噬,這些分子統(tǒng)稱為Atg(Autophagy-related)家族。微管相關(guān)蛋白 1 輕鏈 3(Microtubule-associated protein lA/1B-1ightchain3,LC3)是自噬過程的關(guān)鍵蛋白,貫穿于自噬的全過程,是酵母Atg8的同源物。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),LC3先被Atg4裂解形成水溶性LC3-Ⅰ,然后在Atg7和Atg3的催化下,與脂酰乙醇胺結(jié)合脂化形成LC3-Ⅱ。脂溶性的LC3-Ⅱ成為自噬體的內(nèi)外膜上的標(biāo)記蛋白,其含量與自噬體的數(shù)量成正比。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ已被公認(rèn)為是Western blot檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。近年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病(如呼吸道感染、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等)發(fā)病機(jī)制的研究中取得了長足的進(jìn)步。Tanaka A等人發(fā)現(xiàn)吸煙導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧分子,通過磷酸化JNK激活LC3-Ⅱ,使用抗氧化劑可抑制LC3-Ⅱ的表達(dá)。在哮喘的發(fā)病過程中,自噬可影響Thelper(Th)1、Th2的分化及平衡,介導(dǎo)哮喘相關(guān)病原體的免疫炎癥反應(yīng)。Dickinson JD等人研究認(rèn)為IL-13能通過誘導(dǎo)自噬調(diào)節(jié)呼吸道杯狀細(xì)胞的合成與分泌;Martin等人報(bào)道兒童哮喘與Atg5和Atg7的多態(tài)性相關(guān),急性哮喘發(fā)作的患者中鼻腔粘膜上皮細(xì)胞Atg5的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。呼吸道的粘膜均來源于原腸胚內(nèi)胚層,粘膜上皮細(xì)胞以假復(fù)層纖毛柱狀上皮為主。鼻腔、鼻竇粘膜與呼吸道粘膜相互延續(xù),很多疾病存在多方面的相互作用和影響,近年來學(xué)者提出“同一氣道,同一疾病”的理論。因而,我們推測CRS的鼻粘膜上皮細(xì)胞的自噬水平是否發(fā)生變化,查找國內(nèi)外文獻(xiàn)僅有臺(tái)灣課題組研究認(rèn)為鼻息肉的自噬水平降低,與環(huán)氧合酶-2高表達(dá)有關(guān),而CRS的鼻粘膜上皮細(xì)胞自噬水平未見報(bào)道。自噬在CRS發(fā)病機(jī)制中扮演的角色需要進(jìn)一步研究和探討。本課題第一部分先從mRNA、蛋白水平檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3在CRS組織中的表達(dá)情況;分離培養(yǎng)CRS的原代人鼻粘膜上皮細(xì)胞,利用透射電鏡及熒光顯微鏡觀察自噬表達(dá)情況。第二部分用LPS刺激人正常鼻粘膜上皮細(xì)胞,檢測不同濃度LPS對(duì)人鼻粘膜上皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響;利用透射電鏡及GFP-LC3融合蛋白熒光顯微鏡下觀察自噬的標(biāo)志結(jié)構(gòu);Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及自噬相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平,探討AMPK-mTOR信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的人鼻粘膜上皮細(xì)胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信號(hào)通路與自噬的關(guān)系。第一部分慢性鼻竇炎中鼻腔粘膜上皮細(xì)胞自噬水平的初步研究研究目的:從mRNA、蛋白水平檢測LC3-Ⅱ在CRS中的表達(dá)水平;分離培養(yǎng)CRS的原代鼻粘膜上皮細(xì)胞,利用透射電鏡及免疫熒光顯微鏡分別觀察自噬體及GFP-LC3融合蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)方法:1.術(shù)中收集18例慢性鼻竇炎(不伴有息肉)患者和10例對(duì)照組的鉤突粘膜作為樣本。2.利用免疫組織化學(xué)染色法分別檢測LC3-Ⅱ在CRS組和對(duì)照組中的定位及表達(dá)水平的差異。3.TRIzol法從28例樣本中提取總RNA,反向轉(zhuǎn)錄為cDNA,用qRT-PCR方法比較了兩組樣本中LC3表達(dá)差異。4.分離培養(yǎng)CRS及對(duì)照組的人鼻粘膜上皮原代細(xì)胞,透射電鏡觀察CRS組細(xì)胞內(nèi)的自噬體并計(jì)數(shù);通過轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)記GFP-LC3質(zhì)粒,熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的自噬體的分布狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)分析。5.結(jié)果用SPSS18.0軟件分析,用Fisher檢驗(yàn)分析結(jié)果,P0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,CRS組和對(duì)照組鉤突粘膜組織中LC3-Ⅱ均表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,弱陽性及陽性時(shí)呈黃色、棕黃色;強(qiáng)陽性時(shí)呈棕褐色,細(xì)胞膜和間質(zhì)也可染色。LC3-Ⅱ在88.9%(16/18)CRS鉤突粘膜組織中高表達(dá),而僅在30%(3/10)的對(duì)照組中高表達(dá),差異顯著(P = 0.003)。2.qRT-PCR結(jié)果顯示LC3-Ⅱ mRNA在CRS組和對(duì)照組鉤突粘膜組織中相對(duì)表達(dá)量均值分別為(3.188±0.3887)和(1.025±0.1543)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,LC3-ⅡmRNA在CRS組中表達(dá)明顯增加(P0.001)。3.透射電鏡下,分離培養(yǎng)的CRS的鼻粘膜上皮原代細(xì)胞可觀察到典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。4.將GFP-LC3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CRS鼻粘膜上皮原代細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察到CRS組綠色的熒光點(diǎn)主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,而對(duì)照組的鼻粘膜上皮原代細(xì)胞僅可見少量的熒光點(diǎn),差異顯著。結(jié)論:CRS的鼻腔粘膜上皮細(xì)胞自噬水平明顯上調(diào),提示自噬可能參與了 CRS的致病過程。第二部分脂多糖通過AMPK-mTOR信號(hào)通路調(diào)控人鼻粘膜上皮細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究研究目的:探討AMPK-mTOR信號(hào)通路在LPS誘導(dǎo)的人鼻粘膜上皮細(xì)胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信號(hào)通路與自噬的關(guān)系實(shí)驗(yàn)方法:1.建立LPS感染人正常鼻粘膜上皮細(xì)胞的模型,CCK-8檢測不同濃度LPS對(duì)人鼻粘膜上皮細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀分析不同濃度LPS對(duì)人鼻粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響。2.不同濃度LPS(0、1、5、10μg/ml)處理人鼻粘膜上皮細(xì)胞12h;另外一組加入10μg/ml的LPS,培養(yǎng)不同時(shí)間(0、6、12、24h)后,分別收集細(xì)胞,提取總蛋白,Western blot檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和SQSTM1(P62)蛋白表達(dá)水平,測定不同濃度和不同處理時(shí)間對(duì)自噬的影響。3.透射電鏡觀察LPS處理后的鼻粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)含有雙層膜的自噬小體并計(jì)數(shù)。4.通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)記GFP-LC3質(zhì)粒的方法,熒光顯微鏡下觀察人鼻粘膜上皮細(xì)胞中的綠色熒光點(diǎn)的分布狀態(tài)并計(jì)數(shù)。5.采用不同濃度(0、1、5、10μ/ml)LPS刺激人鼻粘膜上皮細(xì)胞,檢測自噬相關(guān)蛋白 P-AKT(Ser473)、AKT、P-AMPK(Tyr1 72)、AMPK、P-mTOR(Ser2448)、mTOR的表達(dá)情況;進(jìn)一步使用AMPK抑制劑Compound C和LPS共同培養(yǎng)人鼻粘膜上皮細(xì)胞,測定自噬通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。6.利用CRS與正常粘膜組織分離培養(yǎng)的鼻腔粘膜的上皮原代細(xì)胞,Western blot檢測 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及 P62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)水平,進(jìn)一步驗(yàn)證信號(hào)通路。7.采用不同濃度(0、1、5、10μg/ml)LPS處理人鼻粘膜上皮細(xì)胞,檢測TLR4、MyD88及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表達(dá)情況;使用TLR4抑制劑Polymyxin B和LPS共同刺激人鼻粘膜上皮細(xì)胞,檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.不同濃度LPS處理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值隨著濃度增加而逐漸升高,差異最明顯是10μg/ml刺激組(P0.01),P62的表達(dá)水平則逐漸降低;同一濃度處理人鼻粘膜上皮細(xì)胞后,隨著刺激時(shí)間的延長,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸升高,在12h處達(dá)到峰值,差異顯著(P0.01),24h時(shí)表達(dá)水平有所下降,但與對(duì)照組仍有差異(P0.05),P62蛋白的表達(dá)水平則相反。2.用10μg/mlLPS與人鼻粘膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)12h后,在透射電鏡下可觀察到融合的雙層膜的自噬囊泡、自噬溶酶體及降解后的自噬空泡。3.將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的人鼻粘膜上皮細(xì)胞在不同濃度(0、1、5、10μg/ml)LPS刺激12h后,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)聚集的GFP-LC3主要分布在細(xì)胞質(zhì),隨著刺激濃度的升高,帶有熒光點(diǎn)自噬體的陽性細(xì)胞比例顯著增加,這與免疫印跡結(jié)果一致。4.用LPS處理人鼻粘膜上皮細(xì)胞后,隨著刺激濃度的增加,P-AMPK表達(dá)量逐漸增高,P-mTOR表達(dá)量逐漸降低,而p-AKT沒有明顯的變化;使用AMPK抑制劑Compound C后,P-AMPK、P-mTOR的表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值介于對(duì)照組與LPS處理組之間。5.利用CRS與正常粘膜組織分離培養(yǎng)的鼻腔粘膜的上皮原代細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示CRS組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高,P62表達(dá)量降低;同時(shí)P-AMPK蛋白相對(duì)表達(dá)量增多,P-mTOR的相對(duì)表達(dá)量減少。6.隨著LPS刺激濃度的增加,TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸升高;進(jìn)一步使用TLR4抑制劑Polymyxin B,TLR4、MyD88的表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均介于對(duì)照組與LPS組之間。結(jié)論:1.LPS能誘導(dǎo)人鼻粘膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬,并呈劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。2.LPS通過AMPK-mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)人鼻粘膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生自噬。3.TLR4/MyD88依賴的信號(hào)通路也參與了 LPS誘導(dǎo)的人鼻粘膜上皮細(xì)胞的噬。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R765.41
【圖文】：

圖２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果逡逑

圖３自噬小體在人鼻粘膜上皮原代細(xì)胞的表達(dá)情況逡逑圖Ａ顯示在ＣＲＳ培養(yǎng)的人鼻粘膜原代上皮細(xì)胞可見雙層膜的自噬小體，而對(duì)未見明顯自噬小體。逡逑Ｂ對(duì)照組與３例ＣＲＳ培養(yǎng)的鼻粘膜上皮細(xì)胞自噬小體的定量分析（＊＊邋Ｐ＜逡逑．０１＊＊＊邋Ｐ＜邋０．００１）。逡逑３

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本文編號(hào)：2722994