【摘要】：一、研究意義鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部的常見腫瘤,它的分布具有明顯的區(qū)域性,尤其是在我國(guó)南方地區(qū),是發(fā)病率比較高的惡性腫瘤之一[1]。雖然,放射治療是治療鼻咽癌的主要手段,但是這只能對(duì)早期和分化程度比較好的鼻咽癌,這類患者經(jīng)過(guò)放射治療其5年生存期可以達(dá)到90%以上;對(duì)于中晚期的患者,單純使用放射治療效果并不好,其中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及局部復(fù)發(fā)率比較高,是導(dǎo)致治療效果不好的主要原因,也是患者的主要死因。因此,探索以及闡明導(dǎo)致鼻咽癌局部復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制,尋找有效的分子治療靶點(diǎn),有助于尋求有效的鼻咽癌治療策略以改善患者的預(yù)后和延長(zhǎng)患者的無(wú)病生存期。纖維鏈接蛋白1(Fibronectin1,FN1)是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(extracellular matrix,ECM)分子。參與細(xì)胞粘附和遷移過(guò)程,包括胚胎發(fā)生,傷口愈合,凝血,宿主防御和轉(zhuǎn)移[2]。文獻(xiàn)報(bào)道稱:FN1的過(guò)表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌和甲狀腺癌的一個(gè)不良信號(hào)[3,4]。它是頭頸鱗狀細(xì)胞癌放射抗性的潛在生物標(biāo)志物。當(dāng)出現(xiàn)鉑類抗藥性時(shí),其在卵巢癌中的表達(dá)出現(xiàn)明顯的升高[5,6]。同時(shí)FN1在乳腺癌細(xì)胞和間質(zhì)中的表達(dá)可以明顯高于癌旁腺上皮以及間質(zhì)[7]。近期研究表明,FN1在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織,并且和鼻咽癌的分期,轉(zhuǎn)移以及生存期呈負(fù)相關(guān)[8]。雖然有學(xué)者對(duì)FN1在鼻咽癌中的表達(dá)進(jìn)行了報(bào)道,但是僅僅是做了差異表達(dá)的分析,未對(duì)FN1在鼻咽癌中遷移侵襲及凋亡的作用進(jìn)行探討,同時(shí)其機(jī)制更是不明確的,所以本課題旨在對(duì)FN1在鼻咽癌細(xì)胞的遷移侵襲以及凋亡中的作用以及其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探討。希望我們的研究可以為將來(lái)的臨床應(yīng)用提高有效的參考。二、研究目的探討FN1在鼻咽癌細(xì)胞增殖、粘附、遷移、侵襲以及凋亡的影響。為逆轉(zhuǎn)鼻咽癌的惡性生物行為,豐富鼻咽癌的治療策略提供理論基礎(chǔ)。三、研究方法1.我們從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GENE數(shù)據(jù),這些組織的載入數(shù)為GSE12452,從GSM312896到GSM312905為正常的健康鼻咽組織,GSM 312906為GSM 312936為鼻咽癌組織。用于分析的芯片為Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0陣列,平臺(tái)為GPL570。為了使數(shù)據(jù)更容易分析和獲得高質(zhì)量的基因,我們使用數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的中值方法。設(shè)置基因過(guò)濾器為:(1)探針的基因表達(dá)不低于中位數(shù)的3倍,變化應(yīng)大于總樣本的20%。(2)缺失值應(yīng)小于基因表達(dá)值的50%。(3)如果與幾個(gè)探針相對(duì)應(yīng)的基因,則只保留最高的IQR。最后,我們發(fā)現(xiàn)FN1明顯上調(diào),折疊變化為9.12。2.細(xì)胞培養(yǎng)將鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和C666-1細(xì)胞置于37℃,含5%濃度的C02,相對(duì)濕度為50%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),用含10%胎牛血清的RPMI-1640和高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)1)慢病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株5-8F和C666-1,干擾FN1基因的表達(dá);2)熒光定量PCR檢測(cè)FN1的干擾情況;3)免疫印跡(western blot)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株的FN1的干擾情況;4)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和遷移、侵襲(transwell實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FN1基因?qū)?xì)胞遷移能力的變化的影響;5)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FN1對(duì)細(xì)胞粘附能力和遷移侵襲的影響;6)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FN1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響;7)細(xì)胞凋亡TUNEL實(shí)驗(yàn)以及流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況的變化;8)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)9)數(shù)據(jù)分析四、研究結(jié)果1.轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)用針對(duì)FN1基因的慢病毒進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中FN1的表達(dá),用實(shí)時(shí)定量Q-PCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)FN1蛋白表達(dá)明顯降低。2.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)各組細(xì)胞的遷移能力劃痕愈合實(shí)驗(yàn)表明:下調(diào)了 FN1的細(xì)胞組鼻咽癌細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯降低,和對(duì)照組相比干擾組的劃痕寬度明顯寬一些。每組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell實(shí)驗(yàn)表明:下調(diào)了 FN1的鼻咽癌細(xì)胞和對(duì)照組相比,遷移侵襲能力明顯降低,穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少。3.細(xì)胞功能學(xué)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的惡性行為細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明:在下調(diào)了 FN1的表達(dá)以后,細(xì)胞的增殖能力、粘附能力,增殖能力均出現(xiàn)了明顯的降低;克隆形成數(shù)明顯少于對(duì)照組。細(xì)胞的凋亡率明顯增加。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.下調(diào)FN1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞在裸鼠皮下成瘤能力的影響。小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度:在下調(diào)了 FN1基因表達(dá)的組中,腫瘤體積小于對(duì)照組,生長(zhǎng)速度明顯減慢。5.Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中 MMP9、MMP2、BCL2、Caspase3 的表達(dá)情況蛋白印跡結(jié)果顯示:下調(diào)了 FN1以后,與腫瘤遷移侵襲相關(guān)的蛋白MMP9和MMP2出現(xiàn)了明顯的降低。和凋亡相關(guān)的蛋白BCL2的表達(dá)降低,Caspase3的表達(dá)出現(xiàn)了明顯升高。同時(shí)NF-kB通路上的基因在FN1的調(diào)節(jié)通路中出現(xiàn)了明顯的改變。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。五、研究結(jié)論1.FN1在鼻咽癌中呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)狀態(tài)。2.下調(diào)了 FN1的表達(dá)可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移侵襲并且可以降低遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP2和MMP9的表達(dá);3.下調(diào)了 FN1的表達(dá)可抑制裸鼠的皮下腫瘤的生長(zhǎng)速度和體積,可以通過(guò)上調(diào)BCL2,下調(diào)Caspase3,來(lái)抑制NPC細(xì)胞的凋亡;4.NF-kB/P65通路參與FN1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控,在下調(diào)了 FN1的表達(dá)的基礎(chǔ)上激活NF/kB的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的凋亡,可能NF-kB/P65通路在FN1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。綜上所述,我們的研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要是指明了 FN1是鼻咽癌細(xì)胞遷移侵襲增殖的促進(jìn)因素,是凋亡的抑制因素,并且其對(duì)凋亡的抑制主要是通過(guò)NF-kB通路來(lái)起作用的。所以下調(diào)了 FN1的表達(dá)可能對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為起到一定的調(diào)控作用,從而為鼻咽癌的治療提供一個(gè)新的方向。
【圖文】：

逡逑圖３．２．２．基因ＦＮ１下調(diào)效率的驗(yàn)證。Ａ和Ｂ是ＲＮＡ水平上的下調(diào)效率的驗(yàn)證。Ｃ和Ｄ逡逑是蛋白水平的下調(diào)效率的驗(yàn)證。無(wú)論在ＲＮＡ邋７］Ｃ平還是蛋白水平ＦＮ１在５－８Ｆ和Ｃ６６６－１細(xì)胞逡逑中的下調(diào)效果都很明顯（Ｐ＜0．0５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２．２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋ｓｈＦＮｌ邋３６ｈ逡逑ｌａｔｅｒ，ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｗａｓ邋ｏｂｖｉｏｕｓ邋ｂｙ邋ｑＰＣＲ邋ｉｎ邋Ｃ６６６－１邋（Ａ）邋ａｎｄ邋５－８Ｆ邋ｃｅｌｌｓ邋（Ｂ）．邋Ｔｈｅ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ｒｅｓｕｌｔｓ逡逑ｓｈｏｗｅｄ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ＦＮ１邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋（Ｃ邋ａｎｄ邋Ｄ）．ＧＡＰＤＨ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｌｏａｄｉｎｇ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋＊Ｐ＜０．０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０１．逡逑３．３邋ＦＮ１明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移侵襲能力逡逑３．３．１劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)了邋ＦＮ１細(xì)胞的遷移能力明顯下降逡逑根據(jù)前邊所述的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕創(chuàng)口的制造，在第２４小時(shí)，３０小時(shí)的逡逑時(shí)候分別對(duì)細(xì)胞愈合能力進(jìn)行拍照并記錄細(xì)胞愈合能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，，逡逑在不同的時(shí)間點(diǎn)，對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的ＦＮ１基因進(jìn)行下調(diào)以后劃痕愈合能力明顯比逡逑對(duì)照組減弱了，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑表３．３：下調(diào)了邋ＦＮ１的表達(dá)，５－８Ｆ和Ｃ６６６－１細(xì)胞中劃痕愈合能力的變化逡逑Ｔａｂｌｅ邋３．３：邋Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ邋ｗｉｔｈ邋ＦＮ１邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

邐＇１１＇°￣邋Ｈｉ邋ｐ逡逑■W 邋Ｊ＾。．５．邋Ｉｐａｌ逡逑＾ＫＢＫｉ邐ＯＨ邋２４Ｈ邐３０Ｈ逡逑圖３．３邋ＦＮｌ對(duì)細(xì)胞愈合能力的影響。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證ＦＮｌ對(duì)細(xì)胞傷口愈合能逡逑力的影響。在５－８Ｆ細(xì)胞系中觀察了邋１２小時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)到１２小時(shí)時(shí)對(duì)照組細(xì)胞己經(jīng)出現(xiàn)了逡逑明顯的愈合，而ｓｈＦＮｌ組中，細(xì)胞的愈合不明顯（圖Ａ）。在Ｃ６６６－１細(xì)胞系中，在對(duì)照組ＮＣ逡逑組中２４，小時(shí)、３０小時(shí)時(shí)，細(xì)胞均出現(xiàn)了比較明顯的愈合，和下調(diào)組之間有明顯的差異（圖逡逑Ｂ）。（Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋．ＥｆＴｅｃｔ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ａｂｉｌｉｔｙ．邋Ｔｌｉｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＦＮ１邋ｏｎ邋ｗｏｕｎｄ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ逡逑ｗａｓ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ｃｅｌｌ邋ｓｃｒａｔｃｈ邋ａｓｓａｙ．邋Ａｆｔｅｒ邋１２邋ｈｏｕｒｓ邋ｏｆ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋５－８Ｆ邋ｃｅｌｌ邋ｌｉｌｉｅｓ，邋ｗｅ邋ｆｏｕｎｄ邋ｔｈａｔ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｈｅａｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｈａｄ邋ｏｃｃｕｒｒｅｄ邋ａｔ邋１２邋ｈｏｕｒｓ，邋ｂｕｔ邋ｎｏｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｈＦＮｌ逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2706476