【摘要】：目的通過(guò)離體原代培養(yǎng)人眼Tenon’s囊成纖維細(xì)胞,模擬體外青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕形成的過(guò)程,檢測(cè)正常的成纖維細(xì)胞和活化了的肌成纖維細(xì)胞中microRNA-29b和p53的表達(dá)水平調(diào)控關(guān)系,探討青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)道瘢痕形成的機(jī)制。方法取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科手術(shù)室2016年3月至2016年7月眼科斜視手術(shù)病人術(shù)眼正常Tenon’s囊組織,用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)出原代成纖維細(xì)胞,傳代至2-4代并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用TGF-β1(10ng/ml)將成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞,分別用qPCR和IHC技術(shù)檢測(cè)p53 mRNA和蛋白在成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞中在表達(dá)水平。用si RNA轉(zhuǎn)染抑制成纖維細(xì)胞中p53的表達(dá),使用qPCR檢測(cè)miRNA-29b和p53在成纖維細(xì)胞、活化的肌成纖維細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后的肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況。再用SPSS16.0軟件等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果1.用組織塊培養(yǎng)法約2周左右可見(jiàn)細(xì)胞從組織邊緣爬出,6-8周可細(xì)胞可鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底,在放大10倍的倒置顯微鏡下可見(jiàn)成纖維細(xì)胞體積較大,呈典型的扁平長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核居中,呈規(guī)則卵圓形,細(xì)胞之間成螺旋狀排列。將細(xì)胞傳代后用TGF-β1(10ng/ml,48h)活化后,細(xì)胞由成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞,細(xì)胞體積增大且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,邊緣毛躁,細(xì)胞之間呈無(wú)序狀態(tài)。2.分別將成纖維細(xì)胞和活化的肌成纖維細(xì)胞消化爬片后,按照免疫組化步驟操作,DAB染色后,倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核著色深染,而細(xì)胞質(zhì)未著色,說(shuō)明p53蛋白表達(dá)于細(xì)胞核中,呈黃褐色彌漫性分布,細(xì)胞質(zhì)中未見(jiàn)表達(dá)。根據(jù)著色深淺可以看出MFs中p53蛋白的表達(dá)量明顯高于HTFs組。選用image proplus軟件對(duì)免疫組化所有圖片根據(jù)染色著色程度不同進(jìn)行分析,獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)顯示:各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布,兩組細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)量MFs組(0.0419±0.0124)高于HTFs(0.0089±0.0085)組,t=-10.384,P0.05,N=3,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.將HTFs細(xì)胞及MFs細(xì)胞提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,經(jīng)過(guò)qPCR比較p53mRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),分析HTFs及MFs細(xì)胞中p53的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與HTFs(1±0.0672)比較,MFs中p53的表達(dá)量(4.8650±0.2577)明顯增高,t=-19.821,p0.05,N=3,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.將HTFs細(xì)胞,MFs細(xì)胞及siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,用qPCR驗(yàn)證p53mRNA相對(duì)表達(dá)量,觀察p53是否轉(zhuǎn)染成功,再用qPCR檢測(cè)miRNA-29b的相對(duì)表達(dá)量。qPCR結(jié)果顯示,三組細(xì)胞中miR-29b的表達(dá)量從高到低依次為:siRNA-p53轉(zhuǎn)染組,HTFs正常組,MFs活化組,采用KruskalWallis H檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)各組細(xì)胞中p53的表達(dá)量及miR-29b的表達(dá)量進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)各組中,p53:HTFs組1(1,1),MFs組3.9750(1.6350,6.2452),siRNA轉(zhuǎn)染組0.0560(0.0112,0.1195),陰性對(duì)照組0.9750(0.8300,1.1200)。miR-29b:HTFs組1(1,1),MFs組0.5450(0.4500,0.6100),siRNA轉(zhuǎn)染組5.0500(3.0875,4.1700),陰性對(duì)照組1.0250(0.9475,1.1250),用KruskalWallis H檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各組p53mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,X2=15.928,雙側(cè)P值為0.000,認(rèn)為各組之間有差別,再將各組進(jìn)行兩兩比較,除陰性對(duì)照組與HTFs組P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余各組中p53的表達(dá)量均有差異,p0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣,用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各組miR-29b數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,X2=22,雙側(cè)P值為0.000,認(rèn)為各組之間有差別,再將各組進(jìn)行兩兩比較,除陰性對(duì)照組與HTFs組P0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外,其余各組中miR-29b的表達(dá)量均有差異,p0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)比較HTFs細(xì)胞及MFs細(xì)胞遷徙能力,發(fā)現(xiàn)HTFs活化為MFs后,細(xì)胞的遷徙能力增強(qiáng)。結(jié)論活化了的MFs中,p53mRNA及p53蛋白表達(dá)均增高,而miRNA-29b表達(dá)降低,下調(diào)p53表達(dá)后,MiRNA-29b表達(dá)上調(diào),說(shuō)明MiRNA-29b可能通過(guò)下調(diào)p53的表達(dá)而抑制青光眼術(shù)后濾過(guò)道瘢痕的形成。
【圖文】：

3.結(jié)果3.1Tenon’s 囊組織原代培養(yǎng)出的 HTFs 形態(tài)特點(diǎn)用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，約 2周左右，可見(jiàn)組織塊周圍有散在小的長(zhǎng)梭形細(xì)胞（圖 1A），組織塊邊緣有長(zhǎng)梭形細(xì)胞游離出，后細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在組織塊周圍呈放射狀密集生長(zhǎng)，各個(gè)組織塊周圍細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，約 3-4周細(xì)胞間逐漸相互接觸連接，約 6-8 周左右（圖 1B），，細(xì)胞可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)組織塊周圍成纖維細(xì)胞，呈典型的扁平長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核居中，呈規(guī)則卵圓形，沿著組織塊放射狀生長(zhǎng)，細(xì)胞之間成螺旋狀排列。

quickly.Cell growed around the tissue block radially. The ach other and arranged spirally.后的形態(tài)學(xué)觀察合生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底部面積 80％左右時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)化傳代，被胰酶消化的細(xì)胞呈橢圓形或者短梭形懸浮箱中，放置約 6小時(shí)，取出倒置顯微鏡下觀察，大部 HTFs 形態(tài)粗短，繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞已完全一致，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)日后可見(jiàn)細(xì)胞間再次融合，呈螺旋
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R779.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2696144