【摘要】：背景:藍(lán)光在日常生活中隨處可見,適量藍(lán)光對維持視功能和晝夜節(jié)律具有重要意義,而強(qiáng)藍(lán)光照射可引起RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷。年齡相關(guān)性黃斑變性的病程與光損傷有相似之處,但激光和抗VEGF藥物均不能達(dá)到理想的療效,因此構(gòu)建光損傷的動(dòng)物模型對研究年齡相關(guān)性黃斑變性意義非凡。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可旁分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子保護(hù)視網(wǎng)膜,具有可塑性,且在宿主體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,因此在視網(wǎng)膜疾病的研究中被廣泛應(yīng)用。CNTF可促進(jìn)RPE細(xì)胞存活,加速光感受器的更新,促進(jìn)Müller細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等,從而保護(hù)視網(wǎng)膜。但CNTF蛋白在眼內(nèi)作用時(shí)間短,需通過反復(fù)多次注射維持其對視網(wǎng)膜的作用,增加眼內(nèi)炎和眼球結(jié)構(gòu)破壞的風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過構(gòu)建CNTF修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,探討其對藍(lán)光損傷視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。目的:體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞,飼養(yǎng)SD大鼠,通過藍(lán)光照射在細(xì)胞和動(dòng)物水平建立藍(lán)光損傷模型,研究過表達(dá)CNTF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對藍(lán)光損傷的RPE細(xì)胞和SD大鼠視網(wǎng)膜的影響,進(jìn)一步研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)基因修飾后功能的變化,為治療視網(wǎng)膜疾病提供新策略。方法:分離提取視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,分別培養(yǎng)至1代和3代,進(jìn)行細(xì)胞鑒定。分別利用腺病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,使其過表達(dá)CNTF。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs與藍(lán)光損傷的RPE細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,在藍(lán)光損傷的SD大鼠視網(wǎng)膜下腔分別移植CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs,檢測RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜中的氧化損傷指標(biāo)MDA和抗氧化指標(biāo)SOD,ELISA檢測細(xì)胞和視網(wǎng)膜中VEGF的分泌水平,行視網(wǎng)膜血管鋪片,在熒光顯微鏡下觀察血管的滲漏情況。Baf A1預(yù)處理RPE細(xì)胞,行Western blot檢測共培養(yǎng)后自噬流水平的變化。激光共聚焦顯微鏡下觀察冰凍切片中CK18與GFP的共定位情況,觀測干細(xì)胞的遷移和分化情況。通過TUNEL與LC3免疫熒光共定位檢測,判斷RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜中自噬與凋亡之間的關(guān)系。利用F-ERG檢測,評估CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs對藍(lán)光損傷視網(wǎng)膜視功能的影響。結(jié)果:成功分離培養(yǎng)、鑒定SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)和RPE細(xì)胞。強(qiáng)藍(lán)光照射引起RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜氧化損傷,CNTF-BMSCs通過體外共培養(yǎng)和體內(nèi)視網(wǎng)膜下腔移植,下調(diào)MDA,同時(shí)上調(diào)SOD水平,抑制VEGF的分泌。移植到視網(wǎng)膜下腔的CNTF-BMSCs可表達(dá)CK18,使SD大鼠F-ERG檢測中最大反應(yīng)總振幅增加。結(jié)論:CNTF基因修飾可增強(qiáng)BMSCs對氧化應(yīng)激的抵抗能力,減少視網(wǎng)膜VEGF的分泌量和視網(wǎng)膜血管滲漏,增強(qiáng)自噬抑制視網(wǎng)膜凋亡,并在移植后分化為受損的RPE細(xì)胞,通過細(xì)胞替代作用減輕藍(lán)光對視網(wǎng)膜的損傷。
【圖文】：

AATCTTATGTAAAACATCAGGGCCAGTGGATGGTGTACCAGTGGCAAGTGAGGCAGAGCGACTCCAAGAGAAGGGATGTTAACCAAGCTCTTAGAAACTGAAGGTGACTTCCATCAGGCACTGCCTTTGCCTACCAGCTAGAGGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTATGCTCACAGTGGACTGTGAGGTCTATCATCAGATGGGAATCTCAGCACTTGAAGCAGATGTAGGAATTC pHBAd-MCMV-GFP 載體酶切回

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【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R774

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本文編號：2692576