【摘要】：第一部分Poly I:C、過氧化氫誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥與氧化應(yīng)激損傷目的:干眼癥(DED)是一種多因素導(dǎo)致的淚膜功能障礙,伴隨著不同程度的眼表組織損傷。盡管人們對(duì)它的病因還沒有確切的定論,越來越多的證據(jù)支持炎癥與氧化應(yīng)激的假說。本研究擬通過PolyI:C和過氧化氫(H202)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞(HCECs)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激(oxidative stress)狀態(tài),為進(jìn)一步探尋干預(yù)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法:將體外培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞分為三組,分別為培養(yǎng)基對(duì)照組,25 μg/ml PolyI:C刺激組,500μMH202刺激組。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞的白細(xì)胞介素(interleukin)1β、IL-6和IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)含量,評(píng)估角膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平。通過Cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。以乙酰乙酸雙氯熒光(DCFH-DA)為探針,多功能酶標(biāo)儀記錄吸光值,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)觀察細(xì)胞凋亡情況。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)被剪切的凋亡蛋白(cleavedcaspase)3、磷酸化的yH2AX蛋白及線粒體內(nèi)外細(xì)胞色素(cytochrome)c含量的改變,綜合檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果:25 μg/mlPolyI:C能夠有效激活角膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),IL-1β、IL-6和IL-8三種細(xì)胞因子無論是mRNA轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白質(zhì)翻譯水平,相對(duì)培養(yǎng)基對(duì)照組均有顯著性升高。CCK-8結(jié)果顯示,5000μMH2O2顯著抑制了角膜細(xì)胞增殖活性。H202孵育后的角膜細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA熒光強(qiáng)度明顯升高,且TUNEL綠色熒光陽.性細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多,提示細(xì)胞發(fā)生凋亡。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)可見cleaved caspase-3、磷酸化的yH2AX蛋白含量均顯著提高,cytochrome c有從線粒體內(nèi)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移的趨勢(shì),進(jìn)一步驗(yàn)證了氧化應(yīng)激凋亡通路的激活。結(jié)論:25 μg/mlPolyI:C可有效地誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),上調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。500 μMH202能夠?qū)е陆悄ど掀ぜ?xì)胞ROS代謝失衡,抑制細(xì)胞增殖活性,激活細(xì)胞凋亡通路。第二部分日柏醇對(duì)Poly I:C與過氧化氫所致人角膜上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用目的:在第一部分研究的結(jié)果顯示,25 μg/ml PolyI:C及500 μMH2O2各自能夠高效地誘導(dǎo)HCECs的炎癥反應(yīng)與ROS的代謝失衡。日柏醇(Hinokitiol,HK)是一種萃取自臺(tái)灣檜木的環(huán)庚三烯酚酮相關(guān)化合物,近年來的許多研究論證了其在不同領(lǐng)域的廣泛的生物保護(hù)作用。本部分研究擬探討HK對(duì)第一部分兩種細(xì)胞病理模型的相關(guān)作用。方法:HCECs 經(jīng) 0 μM、25μM、50 μM、100 μM HK 孵育 24 h 后,采用 CCK-8 檢測(cè)HK細(xì)胞毒性。在25μg/mlPolyI:C刺激前2h,給予不同濃度HK預(yù)先孵育,通過RT-qPCR、ELISA觀察IL-1β、IL-6和IL-8的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平變化。在500μMH2O2刺激前2h,給予不同濃度HK預(yù)先孵育,通過CCK-8觀察不同時(shí)間點(diǎn)HCECs增殖活性改變。運(yùn)用DCFH-DA熒光探針、TUNEL法,檢測(cè)100 μMHK干預(yù)對(duì)于氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞ROS含量及細(xì)胞凋亡的影響。并采用Western blot檢測(cè)磷酸化yH2AX、cleaved caspase-3、cytochrome c等凋亡相關(guān)蛋白改變,綜合評(píng)估HK在炎癥與氧化損傷模型中的作用。結(jié)果:25-100 μMHK對(duì)HCECs與培養(yǎng)基對(duì)照組相比均沒有顯著的細(xì)胞毒性。經(jīng)HK預(yù)處理2h后,相對(duì)于溶劑對(duì)照組,IL-1β、IL-6和IL-8的轉(zhuǎn)錄與翻譯均有所降低,隨著HK濃度增加,效果越明顯。不同濃度的HK在不同時(shí)間點(diǎn),對(duì)于H2O2造成的細(xì)胞增值能力降低,有不同程度的恢復(fù)作用。100 μMHK能夠顯著抑制ROS積累,減少凋亡細(xì)胞的數(shù)目。并且降低磷酸化的γH2AX與激活的caspase-3的含量,阻止cytochrome c從線粒體向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。結(jié)論:HK能夠有效地干預(yù)PolyI:C和過氧化氫造成的HCECs炎癥與氧化應(yīng)激損傷,降低促炎細(xì)胞因子釋放,抑制ROS積累,下調(diào)細(xì)胞凋亡通路的激活程度�？赡芫哂斜Ｗo(hù)角膜上皮細(xì)胞,成為新型干眼癥干預(yù)措施的潛能。第三部分日柏醇對(duì)人角膜上皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制目的:在前期實(shí)驗(yàn)中,已成功地建立人角膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激的模型,并發(fā)現(xiàn)日柏醇(HK)能夠有效地干預(yù)PolyI:C和過氧化氫造成的HCECs炎癥與氧化應(yīng)激損傷,降低促炎細(xì)胞因子釋放,抑制ROS積累,下調(diào)細(xì)胞凋亡通路的激活程度。本研究擬探尋HK保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法:HCECs在25μg/ml PolyI:C刺激前2 h,給予100 μM HK預(yù)孵,24 h后取樣行Western blot試驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞總IκBα及細(xì)胞核內(nèi)外NFκBp65亞基的蛋白含量。HCECs在500 μM PolyI:C刺激前2 h,給予100 μM HK預(yù)孵,24 h后取樣,檢測(cè)丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性,及細(xì)胞總抗氧化力(T-AOC),并通過Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白含量變化。結(jié)果:100μμMHK預(yù)孵,可以維持細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白水平,阻滯p65蛋白從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。且通過抑制MDA生成,恢復(fù)SOD、CAT活性,提高T-AOC,緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài),維持Bcl-2/Bax相對(duì)含量,降低凋亡通路的激活。結(jié)論:HK可能通過抑制NFκB通路活化,抑制炎癥反應(yīng);緩解氧化應(yīng)激壓力,穩(wěn)定Bcl-2/Bax相對(duì)含量,減少細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

２５邋ｎｇ／ｍｌ邋ＰｏｌｙＩ：Ｃ邋刺激邋２４邋ｈ邋后，ＲＴ－ｑＰＣＲ邋結(jié)果顯示邋ＨＣＥＣｓ邋細(xì)胞的邋ＩＬ－ｌｐ、ＩＬ－６逡逑和ＩＬ－８的ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄水平相比對(duì)照組顯著升高，ＩＬ－１邋ｐ為對(duì)照組的１０．２倍（Ｐ＝０．０００４，逡逑圖１．１），ＩＬ－６為對(duì)照組的１１．５倍（Ｐ＜０．０００１，圖１．２），ＩＬ－８為對(duì)照組的７．１倍逡逑（Ｐ＝０．０００４，圖邋１．３）。逡逑１５－１逡逑？Ｌ邐￣￣Ｉ￣￣逡逑ｌｌ１０＇逡逑￡邋ｇ邐ｉ邋ｍ邋ｍ邋ｍ邋ｍｎＱ逡逑ｉｆ逡逑ｆ邋５逡逑ｏ°邐＾逡逑圖１．１邋２５噸／１１１圯0１丫１：＜：刺激１？：￡＃福rP玻矗保焙螅嗑保保酟。保保保保奕胱，

本文編號(hào)：2691129