【摘要】：目的:作為糖尿病性視網(wǎng)膜病變分級(jí)的重要標(biāo)志性特征,新生血管是整個(gè)DR發(fā)展中的關(guān)鍵性事件,大量研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞依靠無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生能量來(lái)維持細(xì)胞功能,即形成“分支”,產(chǎn)生新生血管。但高血糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞糖酵解對(duì)新生血管的作用機(jī)制仍不清楚,本研究將探討磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3)在高糖環(huán)境下對(duì)血管新生的可能作用及其機(jī)制。方法:研究主要分為五個(gè)部分:第一部分采用正常糖(5 mmol/L glucose,NG)和高糖(30 mmol/L glucose,HG)分別培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)24 h后,采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot,WB)和實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)正常糖和高糖環(huán)境下PFKFB3的表達(dá);第二部分采用正常糖(5 mmol/L glucose,NG)、正常糖加SiRNA-1(NG+SiRNA-1)、正常糖加SiRNA-2(NG+SiRNA-2)和正常糖加SiRNA-3(NG+SiRNA-3)轉(zhuǎn)染HUVECs后,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,采用WB方法檢測(cè)每組中PFKFB3的表達(dá)。第三部分采用正常糖(NG)、正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA)培養(yǎng)HUVECs后,分別將每組中的HUVECs加入對(duì)應(yīng)的基質(zhì)膠中繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行照相,最后采用ImageJ angiogenesis軟件對(duì)每組進(jìn)行管腔形成能力檢測(cè)。第四部分采用正常糖(NG)和正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)培養(yǎng)HUVECs,采用WB方法檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylation Protein kinase B,pAkt)及蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB or Akt)的表達(dá)。第五部分采用正常糖(NG)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA)培養(yǎng)HUVECs,采用WB方法檢測(cè)pAkt及Akt的表達(dá)。結(jié)果:第一部分高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs相較于正常糖環(huán)境下的PFKFB3蛋白表達(dá)明顯升高(t=5.457,P=0.000,P0.01),且高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs相較于正常糖環(huán)境下的PFKFB3 mRNA表達(dá)也明顯升高(t=4.466,P=0.000,P0.01);第二部分SiRNA-1對(duì)于PFKFB3的抑制效果最為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P0.01);第三部分高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs的管腔形成能力是明顯低于正常對(duì)照組的(P=0.005,P0.01),正常糖加入SiRNA的管腔形成能力相較于對(duì)照組來(lái)說(shuō)也是明顯升高的(P=0.031,P0.05),高糖培養(yǎng)基中加入SiRNA的管腔形成能力相較于單純高糖培養(yǎng)基的管腔形成能力是明顯增加的(P=0.041,P0.05),正常對(duì)照組與高糖培養(yǎng)基中加入SiRNA相比較則沒(méi)有明顯差異(P=0.173,P0.05);第四部分正常糖培養(yǎng)基中加入SiRNA抑制PFKFB3后,HUVECs的pAkt的表達(dá)量相較于單純正常糖培養(yǎng)基中明顯減少(t=16.91,P=0.00,P0.01);第五部分正常糖培養(yǎng)基組中的pAkt表達(dá)明顯高于高糖培養(yǎng)基組(P=0.004,P0.01),高糖培養(yǎng)基加入SiRNA組中pAkt表達(dá)明顯高于高糖培養(yǎng)基組(P=0.000,P0.01),當(dāng)高糖培養(yǎng)基中加入SiRNA時(shí)pAkt表達(dá)則明顯高于正常糖培養(yǎng)基組(P=0.008,P0.01)。結(jié)論:抑制PFKFB3可以明顯減輕高糖環(huán)境誘導(dǎo)的病理性新生血管,明顯提高因高糖環(huán)境降低的保護(hù)性因子pAkt的表達(dá),從而起到保護(hù)HUVECs細(xì)胞的作用。PFKFB3有望作為防治因高糖環(huán)境誘導(dǎo)的新生血管的一個(gè)新靶點(diǎn)。
【圖文】：

1 正常組與高糖環(huán)境下 PFKFB3 的表達(dá)：本研究正常傳代 HUVECs，待細(xì)胞融合到 70%左右時(shí)開(kāi)始用于實(shí)驗(yàn)，分別使用正常糖培養(yǎng)基及高糖培養(yǎng)基培養(yǎng) HUVECs 48 h，分別進(jìn)行 WesternBlot 及 RT-PVR 檢測(cè)。Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示：48 h 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs(1.514±0.1191，N=9)相較于正常糖環(huán)境下(1.00, N=9)的 PFKFB3明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.457, P=0.00, P<0.05)（圖 1.）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示：48h 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的 HUVECs(1.350±0.083，N=5)相較于正常糖環(huán)境下的PFKFB3明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.466, P=0.00,P<0.05)（圖 1.）

高糖培養(yǎng)基中加入 SiRNA 的管腔形成能力相較于單純高糖培養(yǎng)基的是明顯增加的(P=0.041, P<0.05)（圖3.），，而正常對(duì)照組與高糖培養(yǎng)基中加入 SiRNA 相比較是沒(méi)有明顯差異的(P=0.173, P>0.05)（圖 3.）。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R774.1

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本文編號(hào)：2688612