【摘要】：目的:觀察濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)患者抗新生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)藥物治療后房水中微小RNA(miRNA)水平改變,并探討其與預(yù)后的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制。方法:1、選取20例(20眼)濕性AMD患者,簽署知情同意書。分別在第一次、第二次行玻璃體腔注射抗VEGF藥物時(shí)抽取約50ul房水,通過mi RNA衍生片段長(zhǎng)度多肽性(miRFLP)直接測(cè)定法檢測(cè)房水中16種可能相關(guān)的miRNA水平,分析抗VEGF治療前后mi RNA水平變化,篩選出有規(guī)律變化的miRNA種類,然后比較其與中心視網(wǎng)膜厚度(CMT)變化的相關(guān)性。2、采用HUVEC細(xì)胞,將與CMT有相關(guān)性的miRNA過表達(dá),檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的目的基因及蛋白的水平,探討可能的作用機(jī)制。通過TargetScan算法分析該miRNA的潛在靶點(diǎn),將預(yù)測(cè)出的靶基因與血管生成強(qiáng)相關(guān)的TGF-β家族進(jìn)行交叉對(duì)比,選出實(shí)驗(yàn)的目的基因及蛋白。實(shí)驗(yàn)分為藥物對(duì)照組、miRNA mimic組、mimic陰性對(duì)照組。通過qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率以確定實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染濃度。通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞活性以確定實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染時(shí)間。采用上述轉(zhuǎn)染濃度及轉(zhuǎn)染時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)各組目的基因及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1、篩選出抗VEGF治療前后房水miRNA變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miR-17-5p(t=-4.134,P=0.001)及miR-146a(t=-4.566,P=0.000);治療前后房水中miRNA表達(dá)量改變與CMT改變的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示:miR-17-5p(r=-0.528,P=0.017),miR-146a(r=0.226,P=0.339)。2、選出的靶基因?yàn)門GF-β_2和GDF11。qRT-PCR結(jié)果顯示:miRNA(miR-17-5p)最佳轉(zhuǎn)染濃度為50nM。CCK8結(jié)果顯示:miRNA(miR-17-5p)最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為24h。qRT-PCR結(jié)果顯示:與藥物對(duì)照組相比,miRNA(miR-17-5p)mimic組的TGF-β_2表達(dá)水平明顯下降(t=26.669,P=0.001),mimic陰性對(duì)照組的表達(dá)水平無明顯變化(t=0.956,P=0.440);與藥物對(duì)照組相比,miRNA(miR-17-5p)mimic組的GDF11表達(dá)水平明顯上升(t=-3.357,P=0.028),mimic陰性對(duì)照組的表達(dá)水平無明顯變化(t=-1.420,P=0.292)。Western Blot結(jié)果顯示:與藥物對(duì)照組相比,miRNA(miR-17-5p)mimic組的TGF-β2表達(dá)量明顯下降(t=13.046,P=0.000),mimic陰性對(duì)照組的表達(dá)量無明顯變化(t=-0.559,P=0.632);與藥物對(duì)照組相比,miRNA(miR-17-5p)mimic組的GDF11表達(dá)量明顯上升(t=-21.714,P=0.002),mimic陰性對(duì)照組的表達(dá)量無明顯變化(t=0.674,P=0.537)。結(jié)論:1、抗VEGF藥物治療后,患者房水中mi RNA-17-5p表達(dá)量與黃斑結(jié)構(gòu)改善正相關(guān)。2、上調(diào)miRNA-17-5p可能通過抑制TGF-β_2、促進(jìn)GDF11的表達(dá),進(jìn)而參與到抗VEGF治療的“應(yīng)答”過程。
【圖文】：

1 體外培養(yǎng)的 HUVEC 細(xì)胞，單層貼壁生長(zhǎng)，大小形態(tài)較一致。R 檢測(cè) miR-17-5p 轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)效果，向 HUVEC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度（對(duì)照組、50nic，分別于 24h、48h 后收集細(xì)胞。qRT-PCR 結(jié)果示，隨后 miR-17-5p 的相對(duì)表達(dá)水平分別為（1.00±0.00）、（56）；48h 后 miR-17-5p 的相對(duì)表達(dá)水平分別為（1.00±0.073±11.27）。24h 與 48h 相對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染濃度的轉(zhuǎn)染效率差異00nM 的轉(zhuǎn)染效率也無顯著差異（P＞0.05）。因此，，本實(shí)ic 及其陰性對(duì)照的處理濃度，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)（CCK8）胞經(jīng)貝伐單抗、miR-17-5pmimic（50nM）及其陰性對(duì)照（已額外設(shè)置不對(duì)細(xì)胞做任何處理的空白對(duì)照組），相對(duì)24h 各組分別與其相應(yīng)空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意其相應(yīng)空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文TGF-β2的 mRNA 表達(dá)量在 miR-17-5p mimic 組明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=26.669,P=0.001）；在 mimic 陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.956,P=0.440）；GDF11 的 mRNA 表達(dá)量在 miR-17-5p mimic 組明顯上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-3.357,P=0.028）；在 mimic 陰性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.420,P=0.292）。具體見圖 2。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R774.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 張敏;儲(chǔ)三軍;曾繁星;徐海峰;;Bevacizumab 對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響[J];眼科新進(jìn)展;2014年04期

本文編號(hào)：2687262