發(fā)布時(shí)間：2020-05-28 18:00

【摘要】：目的:Alport綜合征是一種以進(jìn)行性腎功能衰竭、感音神經(jīng)性耳聾以及眼部異常為特征的遺傳性疾病。col4a3基因敲除鼠是Alport綜合征的疾病模型,已在腎、耳部得到認(rèn)證,但是眼部卻鮮有研究。本次試驗(yàn)將通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型小鼠與col4a3基因敲除鼠視網(wǎng)膜基底膜(Bruch's membrane)部IV型膠原蛋白α鏈的分布、以及其他相關(guān)成分的分布情況,對(duì)比兩種小鼠的異同;以及通過(guò)電子顯微鏡及組織學(xué)技術(shù)來(lái)驗(yàn)證col4a3基因敲除鼠的視網(wǎng)膜Bruch's membrane是否有異常表現(xiàn),檢測(cè)col4a3基因敲除鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和視細(xì)胞是否存在損害,以此來(lái)初步推測(cè)col4a3基因敲除鼠是否能成為Alport綜合征眼部視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型。研究方法:1.通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)野生型小鼠與col4a3基因敲除鼠視網(wǎng)膜基底膜(Bruch's membrane)部IV型膠原蛋白α鏈分布、以其他相關(guān)成分的分布情況,對(duì)比兩種小鼠IV型膠原蛋白α鏈以及其他相關(guān)組成成分的異同。2.通過(guò)透射電子顯微鏡及組織學(xué)技術(shù)對(duì)比觀察col4a3基因敲除鼠與野生型小鼠,來(lái)檢驗(yàn)col4a3基因敲除鼠的視網(wǎng)膜Bruch's membrane是否有異常表現(xiàn),同時(shí)檢測(cè)col4a3基因敲除鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層和視細(xì)胞是否存在損害。結(jié)果:1.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在野生型小鼠視網(wǎng)膜基底膜(Bruch's Membrane)中可表達(dá)α1(IV)、α2(IV)、α3(IV)、α4(IV)、α5(IV)IV型膠原蛋白鏈的分布,且信號(hào)較強(qiáng);而col4a3基因敲除鼠視網(wǎng)膜基底膜(Bruch's Membrane)中僅表達(dá)α1(IV)與α2(IV)IV型膠原蛋白鏈的分布,且信號(hào)明顯減弱。2.透射電子顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠的Bruch's Membrane明顯變薄、RPE細(xì)胞之間連接松散、微絨毛結(jié)構(gòu)明顯改變、基底皺褶部分消失。3.組織學(xué)技術(shù)(HE染色)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠的RPE層明顯變薄(P0.001)。4.免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠RPE65信號(hào)明顯改變:RPE色素顆粒分布不均勻且色素顆粒數(shù)量明顯減少;(2)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Ezrin信號(hào)在RPE層微絨毛結(jié)構(gòu)處明顯改變;(3)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠GFAP信號(hào)在視網(wǎng)膜內(nèi)界層到外界層之間明顯增強(qiáng);(4)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Fibronectin信號(hào)在RPE層稍有增強(qiáng);(5)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Laminin5信號(hào)在Bruch's Membrane處稍有減弱;(6)與野生型小鼠相比,col4a3基因敲除鼠Albumin信號(hào)明顯改變,充斥RPE全層且信號(hào)增強(qiáng)。結(jié)論:col4a3基因敲除確實(shí)會(huì)在小鼠視網(wǎng)膜產(chǎn)生病變,初步認(rèn)為col4a3基因敲除鼠可以作為Alport綜合征眼部視網(wǎng)膜病變的動(dòng)物模型。
【圖文】：

道： 1 2 3 4 5 6 7 81 采用 PCR 鑒定方案分析 col4a3 基因敲除鼠的驗(yàn)檢測(cè)小鼠眼部視網(wǎng)膜基底膜區(qū)Ⅳ型 型膠原蛋白 α 鏈在兩種小鼠眼部視網(wǎng)膜基在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次（對(duì)照組）眼部視網(wǎng)膜基底膜區(qū)可見(jiàn) α1~強(qiáng)；α6 鏈不可見(jiàn)；眼部視網(wǎng)膜 RPE 層血；col4a3 基因敲除鼠（實(shí)驗(yàn)組）眼部視網(wǎng)的分布，，但信號(hào)明顯減弱；α3、α4、α5、區(qū)可見(jiàn) α1~α2 鏈的分布，其余均不可見(jiàn)。

圖 2 IV 型膠原蛋白 α 鏈在野生型小鼠眼部視網(wǎng)膜基底膜區(qū)（對(duì)照組）的分布情況（×44）注：健康成年（6 月齡）野生型小鼠眼部新鮮冰凍切片分別由 α1（IV）（A）、α2（IV）（B）α3（IV）（C）、α4（IV）（D）、α5（IV）（E）以及 α6（F）抗體進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)心單箭頭所示Bruch's 基底膜處的信號(hào)，空心單箭頭所示為血管處信號(hào)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2685613