【摘要】：目的建立人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium,RPE)藍(lán)光損傷模型,探討L-型鈣通道是否參與藍(lán)光致人RPE細(xì)胞光損傷過程,藍(lán)光照射與鈣通道中心臟亞型(α1C或Cav1.2)、神經(jīng)內(nèi)分泌亞型(α1D或Cavl.3)和視網(wǎng)膜亞型(α1F或Cav1.4)mRNA表達(dá)之間的關(guān)系及RPE細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度是否發(fā)生變化。 方法將第四代人RPE細(xì)胞隨機(jī)分為四個(gè)組,用2000±500Lux藍(lán)光強(qiáng)度分別照射細(xì)胞3h、6h、9h和12h,24h后終止細(xì)胞培養(yǎng),采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,確定最適宜光照時(shí)間。將體外培養(yǎng)的第四代人RPE細(xì)胞隨機(jī)分為四組,無光照組、光照組、光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組。用2000±500Lux藍(lán)光照射6h,24h后終止細(xì)胞培養(yǎng)。用Real-Time RT-PCR與熒光定量PCR技術(shù)分析各組人RPE細(xì)胞L-型鈣通道中心臟亞型(a1C或Cav1.2)、神經(jīng)內(nèi)分泌亞型(a1D或Cav1.3)和視網(wǎng)膜亞型(α1F或Cav1.4)mRNA的表達(dá)。將第四代人RPE細(xì)胞分為六組：無光照組、光照組、硝苯地平組、光照+硝苯地平組、(-)BayK8644組、光照+(-)BayK8644組。藍(lán)光分別照射RPE細(xì)胞6h,終止細(xì)胞培養(yǎng)24h,采用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長505nm,每組隨機(jī)選取30個(gè)細(xì)胞,掃描細(xì)胞圖像,采用分析軟件分析細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度。用單因素方差分析各組熒光強(qiáng)度差異。 結(jié)果24h終止培養(yǎng)組,光照6h,9h及12h的凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI),與對照組及3h組比較,有顯著的差異性(P0.01)。熒光定量PCR產(chǎn)物α1C、alD、α1F和內(nèi)參ATCB的cDNA分子量分別為68bp、157bp、125bp和186bp,產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶位置與以上分子量相吻合。(1)各組α1C mRNA的表達(dá),光照組、光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組α1C mRNA的表達(dá)均高于無光照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002,0.001,0.000)；光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組α1C mRNA的表達(dá)均高于光照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003,0.000),光照+(-)BayK8644組α1C mRNA的表達(dá)高于光照+硝苯地平組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。(2)各組α1D mRNA的表達(dá),光照組、光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組α1D mRNA的表達(dá)均高于無光照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023,0.006,0.010)；光照+(-)BayK8644組與光照組和光照+硝苯地平組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032,0.039)；光照+硝苯地平組與光照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.459)。(3)各組α1F mRNA的表達(dá),光照組、光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組與無光照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.010,0.000,0.002)；光照+硝苯地平組、光照+(-)BayK8644組α1F mRNA的表達(dá)均高于光照組(P=0.000,0.005),光照+(-)BayK8644組與光照+硝苯地平組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.585)。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示,光照組、光照+硝苯地平組、(一)BayK8644組、光照+(-)BayK8644組RPE胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度高于無光照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,0.000,0.000,0.000),硝苯地平組RPE胞內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度比無光照組低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),硝苯地平組與光照+硝苯地平組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),光照+硝苯地平組與光照組相比較,(-)BayK8644組與光照+(-)BayK8644組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.204,P=0.103)。 結(jié)論(1)光照強(qiáng)度2000±500Lux,光照6h,24h終止培養(yǎng)為建立藍(lán)光照射致人RPE細(xì)胞光損傷模型最適合條件；(2)藍(lán)光照射可引起L-型鈣通道中a1C、α1D及α1F亞型mRNA表達(dá)不同程度的增高,10-5M硝苯地平不能對抗藍(lán)光照射作用而降低人RPE細(xì)胞a1D亞基mRNA表達(dá),而鈣通道激動劑(-)Bay K8644起到相反的作用,L-型鈣通道可能參與藍(lán)光致RPE細(xì)胞損傷過程；(3)藍(lán)光照射人RPE細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加；(4)藍(lán)光照射對RPE細(xì)胞上L-型鈣通道的開放作用強(qiáng)于10-5M硝苯地平的阻滯作用。
【圖文】：

藍(lán)光照射3hHEx40Fig.3aBIUe一rayirradiation3hHEX4O

圖3d藍(lán)光照射12hHEx40Fig3dBlue一rayirradiation1211HE“40頭所指為調(diào)f一的RIJH幻11月包，}滾光照射;3h時(shí)木見調(diào)}‘二細(xì)胞，流光照則一6hl討凋}’細(xì)胞出時(shí)明顯增多，12hj付達(dá)高峰，11_已有少量的壞死細(xì)胞出現(xiàn)，染色質(zhì)邊集，，細(xì)月四形狀消3。一h})A!3染色對以上結(jié)果的驗(yàn)訛叫卜-
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 趙衛(wèi)權(quán),崔黎麗,周長江,林錦明,詹先成;硝苯地平溶液的光解動力學(xué)研究[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年02期

2 張瑤紓,李明強(qiáng),王軍,郭艷娟;硝苯地平光解動力學(xué)的研究[J];中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué);2001年06期

3 周茂金,焦建杰,董偉林,劉艷霞,張才麗,婁建石;硝苯地平注射劑在常用輸液中的光解動力學(xué)[J];中國醫(yī)院藥學(xué)雜志;2004年02期

4 蔡善君;嚴(yán)密;毛詠秋;周焰;劉關(guān)鍵;;藍(lán)光致人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡與線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的關(guān)系[J];中華眼科雜志;2006年12期

5 王雨生,嚴(yán)密;可見光對原代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的光化學(xué)損傷[J];中華眼底病雜志;1996年03期

6 王雨生;視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及其應(yīng)用[J];中華眼底病雜志;1994年02期

7 蔡善君,嚴(yán)密,張軍軍;藍(lán)光誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡[J];中華眼底病雜志;2005年06期

本文編號：2682558