【摘要】：目的研究高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLECs)氧化應(yīng)激過(guò)程,并探討β-酪啡肽-7(β-CM-7)在人晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用及可能機(jī)制。方法1、首先應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的葡萄糖對(duì)細(xì)胞活力的影響,并篩選出與正常葡萄糖濃度最有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的葡萄糖濃度組成為高糖組(本實(shí)驗(yàn)我們把mmol/L簡(jiǎn)寫為m M),用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同濃度的β-CM-7對(duì)HLECs活力的影響,并篩選出與之前選擇的高糖組最有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的濃度組作為β-CM-7組;免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)4個(gè)濃度:5m M、10m M、20m M和40m M的葡萄糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)Foxo1和Sp1表達(dá)的影響。2、按照處理方式不同分為5組:正常對(duì)照組:5m M(control);高糖組:40m M(HG);β-CM-7組:β-CM-7(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的活性氧(ROS)含量;生物酶測(cè)定試劑盒測(cè)定丙二醛(MDA)和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)含量;Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)來(lái)確定Foxo1、Sp1和下游相關(guān)蛋白GSH-px在分子生物學(xué)水平上的表達(dá),Foxo1和Sp1在細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果1、細(xì)胞經(jīng)不同濃度葡萄糖處理后,HLECs活力隨葡萄糖濃度增加而降低(P㩳0.01),與正常葡萄糖濃度相比,葡萄糖濃度為40m M時(shí),統(tǒng)計(jì)學(xué)意義最顯著(P㩳0.01),在葡萄糖濃度為50m M時(shí),細(xì)胞不可逆死亡;Western blot結(jié)果顯示,在當(dāng)葡萄糖濃度由5m M增高至40m M時(shí),HLECs的Foxo1、Sp1表達(dá)逐漸均減低(P㩳0.01);2、當(dāng)用β-CM-7(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)預(yù)處理后,再用高糖(40m M)處理細(xì)胞,與正常對(duì)照組相比細(xì)胞活力增強(qiáng)(P㩳0.01);與高糖組相比,β-CM-7組ROS、MDA均含量降低(P㩳0.01),SOD表達(dá)增高(P㩳0.01);Western blot結(jié)果顯示,與高糖組相比,β-CM-7組(10-5mol/L)細(xì)胞內(nèi)總Foxo1表達(dá)量升高(P㩳0.01),Foxo1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,細(xì)胞核內(nèi)的Foxo1表達(dá)量增加(P㩳0.01),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Foxo1表達(dá)量降低(P㩳0.01),GSH-Px的表達(dá)量增加(P㩳0.01)。免疫熒光可以觀察到與正常對(duì)照組相比,高糖組中的Foxo1和Sp1表達(dá)非常弱。而細(xì)胞用β-CM-7(10-5mol/L)預(yù)處理后,Foxo1表達(dá)總量高于高糖組,并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),Sp1在細(xì)胞核中表達(dá)隨Foxo1轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)而變強(qiáng)。結(jié)論1、高濃度葡萄糖降低HLECs活力,增加氧化酶含量,降低抗氧化酶含量,降低Foxo1和Sp1的相對(duì)表達(dá)。2、β-CM-7通過(guò)上調(diào)Foxo1的相對(duì)表達(dá)和促進(jìn)Foxo1核易位來(lái)保護(hù)HLECs免受氧化損傷。
【圖文】：

（二）β-CM-7 預(yù)處理對(duì)細(xì)胞活力的影響通過(guò) MTT 法篩選β-CM-7 的濃度，與 5mM (control）組相比，40mM (HG)組細(xì)胞活力降低（P=0.004）；與 40mM (HG)相比，β-CM-7 組（10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L）細(xì)胞活力增強(qiáng)（P=0.003、P=0.000、P=0.000、P=0.008），β-CM-7 組（10-8mol/L）與 40mM (HG)組相比，沒(méi)有差異（P=0.061），而β-CM-7 組（10-4mol/L）與β-CM-7 組（10-5mol/L）相比，沒(méi)有差異（P=0.056）。如圖 1。

圖 2 Foxo1 和 Sp1 的相對(duì)表達(dá)及灰度值分析注：Foxo1 的表達(dá)量與 5mM(control)組相比，＃P＜0.01；Sp1 的表達(dá)量與 5mM(control)組相比，，＊P＜0.01。三、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS 的檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞在不同處理方式下產(chǎn)生的 ROS 含量，不同組間相比有差異（F=458.24, P=0.000）；與正常對(duì)照組相比，高糖組產(chǎn)生的 ROS 顯著增多（P=0.004）；當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度β-CM-7 預(yù)處理后，與高糖組相比，β-CM-7組（10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L）ROS 水平降低（P=0.000、P=0.008、P=0.002）；β-CM-7 三組間比較：與β-CM-7 組（10-5mol/L）相比，β-CM-7 組（10-6mol/L、10-7mol/L）ROS 水平升高（P=0.010、P=0.016）；與β-CM-7 組（10-6mol/L）相比，β-CM-7 組（10-7mol/L）ROS 水平升高（P=0.032）。如圖3、表 1。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R587.2;R776.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677276