【摘要】：第一部分NLRX1調(diào)控順鉑耳毒性與ROS/JNK信號(hào)關(guān)系的研究Study on the relatiohship of NLRX1 and ROS/JNK Signaling in Regulating Cisplatin-induced Ototoxity目的:順鉑是常用于癌癥治療的有效化療藥物,但由于其嚴(yán)重的耳毒性而限于使用,目前認(rèn)為活性氧(ROS),線粒體損傷,細(xì)胞凋亡和炎癥損傷參與順鉑耳毒性的發(fā)病機(jī)理,但確切機(jī)制尚不明了。含核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸重復(fù)序列的蛋白家族成員X1(NLRX1)位于細(xì)胞線粒體,可識(shí)別胞漿模式識(shí)別受體,與ROS產(chǎn)生、線粒體功能、細(xì)胞凋亡以及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究旨在探索NLRX1在順鉑耳毒性中是否存在調(diào)控作用及其調(diào)控機(jī)制,為闡明順鉑耳毒性機(jī)制和預(yù)防順鉑耳毒性的發(fā)生提供新思路和理論基礎(chǔ)。方法:(1)通過免疫熒光,實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qRT-PCR)及Western-blot方法檢測(cè)NLRX1在HEI-OC1聽細(xì)胞系內(nèi)的定位及表達(dá)。(2)TT法結(jié)合TUNEL、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)順鉑對(duì)HEI-OC1細(xì)胞活力的影響以及細(xì)胞凋亡變化。(3)qRT-PCR及Western-blot方法檢測(cè)順鉑刺激下NLRX1在HEI-OC1細(xì)胞中的表達(dá)變化,免疫熒光檢測(cè)順鉑刺激下ROS產(chǎn)生水平。(4)通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建NLRX1過表達(dá)及NLRX1沉默細(xì)胞,通過小鼠內(nèi)耳基底膜原代培養(yǎng)建立小鼠順鉑內(nèi)耳損傷的體外模型。(5)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)順鉑在NLRX1沉默及其過表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況,Western-blot技術(shù)檢測(cè)NLRX1沉默及其過表達(dá)細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)因子 cleaved caspase3,bax及bcl-2的表達(dá)變化,評(píng)估線粒體凋亡信號(hào)。(6)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NLRX1沉默及其過表達(dá)細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生水平,Western-blot技術(shù)檢測(cè)NLRX1沉默及其過表達(dá)細(xì)胞中順鉑刺激對(duì)JNK磷酸化水平的影響,檢測(cè)JNK信號(hào)激活情況。(7)阻滯ROS/JNK信號(hào),Western-blot檢測(cè)NLRX1過表達(dá)細(xì)胞中順鉑誘導(dǎo)的線粒體凋亡相關(guān)因子cleaved caspase3,bax及bcl-2的表達(dá)變化。(8)通過免疫熒光及Western-blot技術(shù)檢測(cè)順鉑刺激下耳蝸基底膜中NLRX1、ROS/JNK及凋亡信號(hào)變化。結(jié)果:(1)NLRX1在HEI-OC1細(xì)胞中的表達(dá):NLRX1在HEI-OC1細(xì)胞中呈點(diǎn)狀表達(dá),并且與線粒體標(biāo)記物Mitotraker共染,表明NLRX1表達(dá)于HEI-OC1細(xì)胞線粒體。(2)順鉑誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡及細(xì)胞損傷:隨著順鉑作用濃度以及時(shí)間的增加,HEI-OC1的細(xì)胞活力逐漸下降,并呈現(xiàn)出時(shí)間和濃度依賴性的特點(diǎn),順鉑可以通過誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞凋亡引起細(xì)胞死亡。(3)順鉑促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞NLRX1表達(dá)和ROS產(chǎn)生:在順鉑刺激下,NLRX1表達(dá)升高,并在24小時(shí)達(dá)到峰值,ROS隨著順鉑作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高并于24小時(shí)達(dá)到峰值。(4)NLRX1增加順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞凋亡:NLRX1通過影響cleaved caspase3,bax及bcl-2凋亡相關(guān)因子表達(dá)激活線粒體途徑細(xì)胞凋亡。(5)NLRX1沉默下調(diào)順鉑引起的的ROS產(chǎn)生及JNK信號(hào)激活,NLRX1過表達(dá)上調(diào)順鉑引起的的ROS產(chǎn)生及JNK信號(hào)激活。(6)NLRX1促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ROS/JNK信號(hào)通路活化有關(guān):抑制ROS過量生成或者JNK信號(hào)激活,顯著減弱了 NLRX1引起的線粒體途徑細(xì)胞凋亡。(7)順鉑刺激下小鼠耳蝸基底膜毛細(xì)胞明顯損傷,NLRX1表達(dá)增加、ROS/JNK信號(hào)及線粒體途徑細(xì)胞凋亡信號(hào)激活。結(jié)論:首次在HEI-OC1聽細(xì)胞揭示了 NLRX1通過激活ROS/JNK信號(hào)啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑,增加順鉑對(duì)內(nèi)耳聽細(xì)胞的毒性作用,闡明了 NLRX1在順鉑耳毒性發(fā)生機(jī)制中的調(diào)控作用。第二部分NLRX1介導(dǎo)的自噬在順鉑致耳毒性中的作用機(jī)制研究Study on the mechanism underlying the action of NLRX1-mediated autophagy in cisplatin-induced Ototoxity目的:NLRX1與活性氧產(chǎn)生、線粒體功能、自噬反應(yīng)密切相關(guān)。本研究旨在探索NLRX1介導(dǎo)的自噬在順鉑耳毒性中的作用機(jī)制,為闡明順鉑耳毒性機(jī)制和預(yù)防順鉑耳毒性的發(fā)生提供新思路。方法:(1)通過免疫熒光、Western-blot檢測(cè)不同劑量順鉑處理組HEI-OC1細(xì)胞中NLRX1、LC3-Ⅱ的表達(dá)變化。(2)利用MTT方法檢測(cè)不同劑量順鉑處理的HEI-OC1細(xì)胞活力。(3)利用透射電子顯微鏡技術(shù)(TEM)檢測(cè)不同處理組HEI-OC1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,自噬小體形成狀況。(4)利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建NLRX1過表達(dá)HEI-OC1細(xì)胞,western-blot檢測(cè)NLRX1及LC3-Ⅱ表達(dá),透射電鏡觀察NLRX1表達(dá)組及轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成情況。(5)免疫熒光及western-blot檢測(cè)NLRX1沉默組(siRNA-nlrxl)及轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SC)HEI-OC1細(xì)胞在順鉑處理后NLRX1、LC3-Ⅱ的表達(dá)變化,MTT方法檢測(cè)相應(yīng)不同處理組的細(xì)胞活力。(6)免疫熒光及western-blot檢測(cè)NLRX1過表達(dá)組(nlrxl-KI)及轉(zhuǎn)染對(duì)照組(vector-control)HEI-OC1細(xì)胞在順鉑處理后NLRX1、LC3-Ⅱ的表達(dá)變化,MTT方法檢測(cè)相應(yīng)不同處理組的細(xì)胞活力。(7)透射電鏡觀察NLRX1過表達(dá)組及轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞線粒體形態(tài)及數(shù)量變化,免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組在順鉑刺激下線粒體ROS水平。(8)抑制ROS產(chǎn)生或者自噬,檢測(cè)順鉑處理后自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ及凋亡相關(guān)因子cleaved-caspase3變化趨勢(shì)。(9)利用免疫熒光及western-blot等技術(shù)在不同處理的體外培養(yǎng)的小鼠耳蝸基底膜檢測(cè)NLRX1表達(dá),ROS水平,自噬活性及cleaved caspase3表達(dá)情況。結(jié)果(1)順鉑促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞LC3-Ⅱ及NLRX1表達(dá):順鉑促進(jìn)LC3-Ⅱ表達(dá)并呈現(xiàn)濃度依賴性特點(diǎn),與NLRX1表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系,與細(xì)胞活力成負(fù)相關(guān)關(guān)系。(2)NLRX1促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞自噬小體聚集:免疫熒光及透射電鏡結(jié)果顯示NLRX1過表達(dá)促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞中自噬小體聚集。(3)NLRX1對(duì)順鉑誘導(dǎo)HEI-OC1細(xì)胞自噬和細(xì)胞毒性的作用:NLRX1沉默減弱順鉑誘導(dǎo)的自噬小體聚集及細(xì)胞毒性,NLRX1過表達(dá)促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的自噬小體聚集及加劇順鉑細(xì)胞毒性。(4)NLRX1過度表達(dá)改變線粒體形態(tài),并促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生:NLRX1過表達(dá)導(dǎo)致線粒體腫脹,線粒體嵴減少及斷裂,增加順鉑誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。(5)抑制ROS可以明顯減弱順鉑誘導(dǎo)的HEI-OC1細(xì)胞自噬和凋亡,減輕順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。(6)順鉑促進(jìn)體外培養(yǎng)耳蝸基底膜中NLRX1表達(dá)及ROS產(chǎn)生,抑制ROS減輕順鉑引起的聽細(xì)胞損傷。(7)抑制ROS明顯減弱順怕處理的基底膜中的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋廣。結(jié)論:本研究表明NLRX1活性的增強(qiáng)促進(jìn)HEI-OC1細(xì)胞自噬發(fā)生,導(dǎo)致線粒體異常并促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的ROS生成,NLRX1介導(dǎo)的自噬可能通過促進(jìn)順鉑引起自噬性死亡加劇耳毒性,本研究為拓寬我們對(duì)藥物引起的毒性機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供了新的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．邋ＮＬＲＸ１在ＨＥＩ－ＯＣ１細(xì)胞中表達(dá)狀況逡逑由于目前還不清楚ＮＬＲＸ１是否表達(dá)于ＨＥＩ－０Ｃ１細(xì)胞，因此，本研究首逡逑先通過免疫熒光法探索ＮＬＲＸ１在ＨＥＩ－０Ｃ１細(xì)胞中的基本表達(dá)狀況。我們?cè)阱义希龋牛桑埃茫奔?xì)胞的胞質(zhì)中觀察到ＮＬＲＸ１邋（綠色染色）呈點(diǎn)狀表達(dá)，并且可以逡逑與線粒體標(biāo)記物Ｍｉｔｏｔｒａｋｅｒ共染（圖ｌａ），說明ＮＬＲＸ１表達(dá)于線粒體，并逡逑且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前有關(guān)ＮＬＲＸ１在其它細(xì)胞表達(dá)于線粒體的報(bào)道相一致。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋也證實(shí)邋ＮＬＲＸ１邋在邋ＨＥＩ－ＯＣ１邋細(xì)胞中的表達(dá)（圖］ｂ）。ＨＥＫ－２９３Ｔ逡逑細(xì)胞作為ＮＬＲＸ１表達(dá)的陽性對(duì)照，亦觀察到ＮＬＲＸ１的表達(dá)。這些研宄結(jié)逡逑果，為我們隨后在體外聽細(xì)胞系中研究ＮＬＲＸ１的作用機(jī)制提供了必要的基逡逑礎(chǔ)。逡逑

２．順鉑誘導(dǎo)ＨＥＩ－ＯＣ１細(xì)胞凋亡引起細(xì)胞損傷逡逑ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)證實(shí)，順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，隨著順鈾作逡逑用濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ＨＥＩ－０Ｃ１細(xì)胞活力逐漸下降（圖２Ａ，逡逑２Ｂ）。在３０｜ｉＭ順鈾處理２４小時(shí)后，細(xì)胞活力降低至５３．４±４．９５５％，，后續(xù)實(shí)驗(yàn)逡逑中我們將選擇該濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。ＴＵＮＥＬ法檢測(cè)的細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，逡逑順鉑處理組的ＴＵＮＥＬ陽性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組（圖３Ａ）。此外，流式細(xì)胞術(shù)逡逑檢測(cè)Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ邋／邋ＰＩ雙染色細(xì)胞結(jié)果顯示，順鉑處理組凋亡細(xì)胞的比例顯著高于逡逑對(duì)相應(yīng)的對(duì)照組（圖３Ｂ）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)順鉑主要通過誘導(dǎo)ＨＥＩ－０Ｃ１細(xì)胞凋逡逑亡來發(fā)揮其耳毒性作用。逡逑＾邐１５０－１邐＾邐１５０－逡逑系邋１００－廠＊￣！邐＾邋１００－邋—Ｌ－１邐＿逡逑１邐廣Ｉ

本文編號(hào)：2676765