【摘要】：第一部分先天性黑蒙癥致病基因Nmnat1復(fù)合雜合突變小鼠各組織中nmnat1與sirt1基因表達(dá)研究背景:先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis,LCA)是一類(lèi)導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的眼部疾病,患兒一般在出生時(shí)或出生一年后呈現(xiàn)嚴(yán)重的視力障礙。該病多是常染色體隱形遺傳病,目前研究報(bào)道了約18種與先天性黑蒙相關(guān)的致病基因。本課題組通過(guò)高通量測(cè)序和外顯子捕獲技術(shù),發(fā)現(xiàn)了 NMNAT1基因突變會(huì)導(dǎo)致9型先天性黑蒙癥發(fā)生。NMNAT1基因通過(guò)編碼一類(lèi)催化NAD+合成的關(guān)鍵酶類(lèi)—煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶,參與NAD+依賴(lài)的多種代謝過(guò)程。SIRT1是一類(lèi)NAD+依賴(lài)的去乙�；�,可進(jìn)行NAD+依賴(lài)性的去乙�；磻�(yīng),并參與代謝疾病,惡性腫瘤,心血管疾病以及神經(jīng)性疾病等多種疾病的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究報(bào)道顯示,NMNAT1基因可與SIRT1直接相互作用,將NAD+轉(zhuǎn)移至SIRT1,從而發(fā)揮去乙�；δ堋Ｓ纱丝梢�(jiàn),NMNAT1蛋白與SIRT1蛋白之間是緊密聯(lián)系的。目的:研究發(fā)現(xiàn)NMNAT1蛋白在多種組織中廣泛表達(dá),其中在視網(wǎng)膜,肝臟,睪丸,骨骼肌等組織中表達(dá)量較高。本文通過(guò)選取NMNAT1基因突變(c.769GA和c.454GT)位點(diǎn)敲入小鼠來(lái)研究NMNAT1與SIRT1在成年突變小鼠全身各組織臟器中表達(dá)水平的差異和組織學(xué)水平的異常。以期了解NMNAT1基因突變對(duì)除眼睛外其它組織的損傷情況。方法:建立NMNAT1基因(c.769GA和c.454GT)復(fù)合雜合突變的小鼠模型。小鼠出生一周后剪取尾巴或腳趾提取基因組DNA,通過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證小鼠基因型。NMNAT1基因(c.769GA和c.454GT)復(fù)合雜合突變小鼠和對(duì)照組同時(shí)培育至20周(之前實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)20周老鼠黑蒙癥表型最為嚴(yán)重),解剖收集各組織獲取組織RNA,并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠各組織RNA表達(dá)水平的差異。選取差異較大的組織,運(yùn)用免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)位置及水平變化,HE染色結(jié)果觀(guān)察相應(yīng)組織細(xì)胞是否有形態(tài)學(xué)病理學(xué)上的病變結(jié)果:NMNAT1基因(c.769GA和c.454GT)復(fù)合雜合突變小鼠的NMNAT1和SIRT1基因在肝臟和睪丸的組織的表達(dá)量明顯下調(diào),并表現(xiàn)出顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在其他組織包括眼睛,肌肉,心臟,腎臟等中沒(méi)有顯著差異。免疫組化結(jié)果同樣顯示突變小鼠NMNAT1和SIRT1表達(dá)水平下調(diào)。HE染色結(jié)果表明突變小鼠的睪丸和肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論:先天性黑蒙癥致病基因NMNAT1(c.769GA和c.454GT)復(fù)合雜合突變除了對(duì)于視網(wǎng)膜造成嚴(yán)重?fù)p傷外,同時(shí)會(huì)對(duì)于肝臟組織和睪丸組織帶來(lái)一定程度的損傷,這兩個(gè)組織的嚴(yán)重?fù)p傷可能是由于NMNAT1基因突變引起SIRT1表達(dá)異常所導(dǎo)致。第二部分SMN1基因新發(fā)突變導(dǎo)致脊髓性肌萎縮癥(SMA)背景:脊髓性肌萎縮(Spinal muscular atrophy,SMA)是一類(lèi)常染色體隱性遺傳病,常伴隨有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行,骨骼肌的萎縮以普遍的肌肉無(wú)力。該病主要由于神經(jīng)元存活基因(Survival motor neuron1,SMN1)發(fā)生缺失或突變所導(dǎo)致。目的:在本研究中我們收集了 3個(gè)脊髓性肌萎縮癥的患病家系,通過(guò)多種篩查手段探測(cè)家系中的先證者致病信息以及攜帶者信息,為這些家系后期的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供臨床實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法:采集先證者以及先證者親屬外周血樣并獲取全基因組DNA,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行SMN1基因拷貝數(shù)篩查。全血RNA提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過(guò)設(shè)計(jì)合適引物和Sanger測(cè)序檢測(cè)家系中的致病點(diǎn)突變。質(zhì)粒構(gòu)建以及后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證點(diǎn)突變?cè)斐蒘MN蛋白定位和功能上的改變,并結(jié)合生物信息學(xué)來(lái)說(shuō)明點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)異常以及致病性。結(jié)果:發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SMN1基因新的突變位點(diǎn)c.728-729delTT(p.Ile243Thrfs12),該突變會(huì)導(dǎo)致第243位氨基酸從異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸并且提前終止形成截短蛋白。細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明該突變會(huì)造成SMN蛋白定位異常。再結(jié)合蛋白功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果確定突變c.728_729delTT為致病突變。另外,在篩查一個(gè)家系的攜帶者時(shí)發(fā)現(xiàn)了中國(guó)家庭中罕見(jiàn)的“2+0”模式(即一條染色體上帶有2個(gè)SMN1基因,另一條染色體上沒(méi)有SMN1)。最后一個(gè)家系的先證者為常見(jiàn)的SMN1基因7號(hào)外顯子缺失。結(jié)論:本課題組發(fā)現(xiàn)了 一個(gè)未曾被報(bào)道過(guò)的SMN1基因新發(fā)突變c.728_729delTT(p.Ile243Thrfs12),經(jīng)過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及生物信息分析均表明該突變?yōu)橹虏⊥蛔儭Ａ硗夂币?jiàn)的“2+0”模式為未來(lái)中國(guó)臨床上篩查SMA提供了可靠的參考依據(jù)。
【圖文】：

眼睛，腎臟和心臟組織中ＮＭＮＡＴ１和ＳＩＲＴ１的表達(dá)并未呈現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)差異。肌肉組織中ＮＭＮＡＴ１表達(dá)未呈現(xiàn)明顯的差異，但ＳＩＲＴ１基因表達(dá)水平上調(diào)。逡逑（如圖３．２）逡逑１６逡逑

５邐＿逡逑Ａ邋Ｇ邋ＣＡＡＴＴＴＣｆｉＣＣＴＴＧ邋ＧＧＣＡＣａ逡逑八八／ｖＷ＼Ｍ／Ｗ＼ＡＭａＭ／ＶＶ＼逡逑圖３．１復(fù)合雜合突變小鼠Ｎ＿ＡＴ１基因測(cè)序結(jié)果圖。兩個(gè)箭頭指向的位置出現(xiàn)雙逡逑峰，分別為兩個(gè)突變位點(diǎn)ｃ．７６９Ｇ＞Ａ和ｃ．４５４Ｇ＞Ｔ。（該測(cè)序過(guò)程是使用ＮＭＮＡＴ１基因逡逑４號(hào)外顯子反向引物）逡逑３．２熒光定董ＰＣＲ結(jié)果逡逑我們選取了邋ＮＭＮＡＴ１基因４５４＋７６９復(fù)合雜合小鼠中參與代謝和生殖的心臟，睪逡逑丸，肝臟，肌肉和腎臟來(lái)檢測(cè)各組織中ＮＭＮＡＴ１和ＳＩＲＴ１的表達(dá)情況。結(jié)果表明，逡逑肝臟，睪丸和腎臟組織中ＮＭＮＡＴ１和ＳＩＲＴ１表達(dá)有所下調(diào)，其中肝臟組織中這兩個(gè)逡逑基因的下調(diào)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，睪丸組織中ＮＭＮＡＴ１基因下調(diào)具有顯著的統(tǒng)逡逑計(jì)學(xué)差異。眼睛，腎臟和心臟組織中ＮＭＮＡＴ１和ＳＩＲＴ１的表達(dá)并未呈現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)逡逑學(xué)差異。肌肉組織中ＮＭＮＡＴ１表達(dá)未呈現(xiàn)明顯的差異，但ＳＩＲＴ１基因表達(dá)水平上調(diào)。逡逑（如圖３．２）逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R774

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3 趙虹;張?bào)@宇;車(chē)守梅;赫丹丹;郭朝暉;;NMNAT1基因?qū)w外原代培養(yǎng)神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育的影響[J];中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志;2013年19期

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6 杜強(qiáng);朱成華;沈立;蔡健康;g踅，

本文編號(hào)：2673818