【摘要】：目的:探討WWOX基因在鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制。方法:1.設(shè)計(jì)并包裝含WWOX基因片段和空載片段的慢病毒載體。分別將攜有WWOX基因片段和空載片段的慢病毒載體通過(guò)體外基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE1構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組CNE1/WWOX和空載組CNE1/CON,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。其中以轉(zhuǎn)染空載片段的慢病毒載體(空載組CNE1/CON)及未經(jīng)轉(zhuǎn)染(空白對(duì)照組CNE1)的細(xì)胞作為對(duì)照。在轉(zhuǎn)染72h后,在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。借助于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)分別測(cè)定三組細(xì)胞中WWOX的mRNA和WWOX蛋白的表達(dá)。2.分別用劃痕實(shí)驗(yàn)和/或Transwell遷移實(shí)驗(yàn)以及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究WWOX過(guò)表達(dá)對(duì)三組細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。用RT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞中E-cadherin的mRNA的表達(dá)。3.通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法來(lái)檢測(cè)三組細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖能力。用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)三組細(xì)胞周期的變化及用Annexin V-APC/7-AAD雙熒光標(biāo)記細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)來(lái)分別檢測(cè)三組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的變化。用Western Blot檢測(cè)AKT、p-AKT、Caspase-3、CleavedCaspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.CNE1/CON和CNE1/WWOX的轉(zhuǎn)染效率分別為96.7±0.7%、95.8±1.0%。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.001、1.010±0.041和104.691±0.418,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組WWOX的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中WWOX蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.151±0.042,0.139±0.10和1.263±0.195,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組WWOX的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX相對(duì)劃痕愈合率分別為(55.67±2.08)%、(58.67±1.15)%和(11.67±1.15)%,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組相對(duì)劃痕愈合率明顯減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX細(xì)胞穿膜數(shù)分別為206.8±3.7個(gè),201.4±3.1個(gè)和58.8±3.0個(gè),實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組的細(xì)胞穿膜數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細(xì)胞穿膜數(shù)分別為114.2±8.7個(gè),109.0±5.9個(gè),31.0±2.2個(gè),實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組的細(xì)胞穿膜數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。RT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞E-cadherin的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000、1.009±0.015和1.393±0.080,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組E-cadherin的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細(xì)胞克隆形成率分別為(71.9±3.4)%、(70.1%±2.3)%和(27.9%±1.7)%,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢,形成的克隆較小,且其克隆形成率明顯少于空載組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)當(dāng)天三組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),從第24h開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組OD值明顯低于空載組和空白對(duì)照組的各時(shí)間點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G0/G1期的細(xì)胞數(shù)分別為(62.31±1.26)%、(59.60±1.87)%和(40.95±2.29)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中G2/M期的細(xì)胞數(shù)分別為(8.38±0.23)%、(8.88±0.87)%和(22.06±1.34)%;CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中S期的細(xì)胞數(shù)分別為(29.30±1.48)%、(31.52±1.28)%和(36.99±1.78)%,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而S期在三組細(xì)胞中變化不大,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.用Annexin V-APC/7-AAD雙染料處理細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON、CNE1/WWOX細(xì)胞凋亡率分別為(4.13±0.10)%、(4.15±0.04)%和(16.54±0.07)%,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測(cè)AKT、p-AKT蛋白和Caspase3、cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.842±0.009,0.843±0.010和0.604±0.006,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組的p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,三組細(xì)胞中AKT的蛋白相對(duì)表達(dá)量變化不大,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.548±0.10,0.546±0.008和0.147±0.06,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組Caspase3的蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然而,三組細(xì)胞中的cleaved-Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.285±0.008,0.287±0.007和0.533±0.004,實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組cleaved-Caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建WWOX過(guò)表達(dá)穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)組CNE1/WWOX細(xì)胞株和空載組CNE1/CON細(xì)胞株。2.WWOX過(guò)表達(dá)可使E-cadherin表達(dá)上調(diào),抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。3.WWOX過(guò)表達(dá)可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力。WWOX過(guò)表達(dá)可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。WWOX過(guò)表達(dá)可能通過(guò)激活A(yù)KT使p-AKT(Ser473)的蛋白表達(dá)水平下調(diào)或/和通過(guò)激活caspase-3,使cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)水平上調(diào),從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞CNE1的細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

圖 1-2 RT-PCR 檢測(cè)三組細(xì)胞中 WWOX 的 mRNA 表達(dá)情況 The mRNA expression of WWOX in three groups of cells was detected by RT-PCR. **P<0.01; ***P<0.001）印跡（Western blot）檢測(cè)WWOX蛋白表達(dá)水平的變化慢病毒轉(zhuǎn)染后，，Western blot結(jié)果顯示 CNE1、CNE1/CON和WOX中WWOX蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.151 ± 0.042，0.13 ± 0.195。實(shí)驗(yàn)組較空載組和空白對(duì)照組中WWOX蛋白表達(dá)水 <0.05)，見(jiàn)圖1-3。從蛋白水平說(shuō)明細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。

圖2-1 WWOX對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1相對(duì)愈合能力的影響（×200）e 2-1. Effect ofWWOX on the relative healing ability of nasopharyngeal carcinoma cell CNE1. （*P<0.05;**P<0.01; ***P<0.001）（×200）WWOX基因后鼻咽癌CNE1細(xì)胞遷移能力的變化ranswell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CNE1、CNE1/CON和CNE1/WWOX中細(xì)胞分別為206.8±3.7個(gè)、 201.4±3.1個(gè)和58.8±3.0個(gè)。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)數(shù)較空載組和空白對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),如Transwell遷移實(shí)驗(yàn)與劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致，進(jìn)一步說(shuō)明WWOX基達(dá)可明顯抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2664887