【摘要】：目的:鼻咽癌在我國(guó)廣東和廣西發(fā)病率高,其起病隱蔽、惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅到了患者的身體健康。近幾年來,大量研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因的失活是鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子2樣1(Stromal cell derived factor 2 like 1,SDF2L1)的表達(dá)下調(diào)與腫瘤的發(fā)生、預(yù)后有關(guān)。本研究主要探討SDF2L1在鼻咽癌中的表達(dá)情況以及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法:1、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫組化方法來檢測(cè)鼻咽癌組織和鼻咽粘膜慢性炎組織中SDF2L1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。2、應(yīng)用qRT-PCR和蛋白印跡法(Western blotting,WB)檢測(cè)人永生化鼻咽上皮NP69細(xì)胞和鼻咽癌CNE1、CNE2Z細(xì)胞中SDF2L1mRNA和蛋白的表達(dá)水平。3、利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),分別轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞并經(jīng)嘌呤霉素篩選,其中轉(zhuǎn)有針對(duì)SDF2L1干擾片段的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)有空載片段的細(xì)胞為空載組,未轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞為對(duì)照組,并用WB檢測(cè)各組SDF2L1蛋白的表達(dá)水平。4.采用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)沉默SDF2L1對(duì)CNE1細(xì)胞增殖能力的影響。5、應(yīng)用細(xì)胞劃痕、Transwell遷移、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)SDF2L1表達(dá)沉默對(duì)CNE1細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。6、應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:1、12例鼻咽癌組織和12例鼻咽粘膜慢性炎組織中SDF2L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.549?0.568,1.254?0.729。相對(duì)于鼻咽粘膜慢性炎組織,鼻咽癌組織中SDF2L1mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯降低,兩者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)(27)0.05)。SDF2L1蛋白在鼻咽癌組織中表達(dá)的陽性率為20.6%(20/97),明顯低于其在鼻咽粘膜慢性炎組織中表達(dá)的陽性率91.4%(53/58),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)(27)0.05)。SDF2L1蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)((49)(29)0.05)。2、SDF2L1 mRNA在NP69、CNE1、CNE2Z細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.006?0.137、0.638?0.048、0.287?0.016;蛋白在NP69、CNE1、CNE2Z細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.980?0.019、0.932?0.025、0.517?0.036,鼻咽癌CNE1和CNE2Z細(xì)胞中SDF2L1 mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯低于NP69,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)均(27)0.05)。3、SDF2L1蛋白在實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.280?0.039、0.935?0.034、0.926?0.031,實(shí)驗(yàn)組中SDF2L1蛋白水平表達(dá)均明顯低于空載組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)(27)0.05)。4、MTT實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)96h的OD值分別為1.135?0.013、1.149?0.021、1.127?0.019,各組細(xì)胞增殖能力無明顯差異,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)均(29)0.05)。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組的細(xì)胞克隆形成率分別為(60.4?6.39)%、(58.67?5.75)%、(59.41?5.02)%,三組比較無明顯差異,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)均(29)0.05)。5、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組中細(xì)胞相對(duì)遷移率為(72.79?0.96)%、(53.06?0.74)%、(52.38?0.65)%,實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞相對(duì)遷移率明顯高于空載組和對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((49)均(27)0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組穿入下室的細(xì)胞數(shù)分別為331?7、254?13、242?9個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿入下室的細(xì)胞數(shù)均明顯高于空載組和對(duì)照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組、空載組、對(duì)照組穿入下室的細(xì)胞數(shù)分別為221?10、140?9、146?7個(gè),實(shí)驗(yàn)組穿入下室的細(xì)胞數(shù)均明顯高于空載組和對(duì)照組,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)。6、與空載組、對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中的E-鈣粘蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P均(27)0.05),基質(zhì)金屬蛋白酶-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P均(27)0.05),而N-鈣粘蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯改變(P(29)0.05)。結(jié)論:1、SDF2L1mRNA和蛋白水平在鼻咽癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào),與鼻咽癌的臨床病理特征無明顯的相關(guān)。2、成功建立了SDF2L1表達(dá)沉默的鼻咽癌CNE1細(xì)胞株。3、SDF2L1表達(dá)沉默可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力無明顯影響。4、鼻咽癌細(xì)胞株SDF2L1低表達(dá)導(dǎo)致與EMT有關(guān)的E-鈣粘蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)改變,提示SDF2L1表達(dá)下調(diào)可能是鼻咽癌發(fā)生浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物,可能參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展。
【圖文】：

生學(xué)位論文 SDF2L1 在鼻咽癌中的表達(dá)及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響本實(shí)驗(yàn)用的 RNAi 慢病毒載體為 GV248（圖 1-1），，由上海吉?jiǎng)P術(shù)有限公司提供。慢病毒載體系統(tǒng)由 pHelper1.0 載體、pHelperV 慢病毒載體三個(gè)質(zhì)粒組成。GV 慢病毒載體中含有 HIV 的基本3’LTR 和一些輔助元件組成，可對(duì)其進(jìn)行改造用于基因功能驗(yàn)根據(jù) SDF2L1 基因 RNA 干擾需求對(duì) GV 進(jìn)行了改造。pHelp含了 HIV 病毒的 gag 基因、pol 基因及 rev 基因，主要編碼病毒及病毒包裝的特異性酶。pHelper2.0 載體主要含有來源單純皰疹-G 基因，用于編碼病毒包裝的包膜蛋白。

DF2L1 基因在鼻咽癌組織和鼻咽粘膜慢性炎組織中的 mRN采用qRT-PCR 方法檢測(cè)12例鼻咽癌組織和12例鼻咽粘膜慢DF2L1mRNA 的表達(dá)。運(yùn)用前面所述的 2-ΔΔCt算法來計(jì)算 SDF2對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：SDF2L1mRNA 在鼻咽癌組織和鼻咽粘中的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.549 0.568，1.254 0.729。鼻咽癌2L1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯低于鼻咽粘膜慢性炎組織，且，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 2-1，圖 1-2）。表 2-1 SDF2L1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量n 2-ΔΔCt( x±s ) P value膜慢性炎組織 12 1.254 0.729 0.015組織 12 0.549 0.568
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：2661414