【摘要】：目的:研究白介素-1(interleukin-1β,IL-1β)在角膜移植免疫排斥反應中的作用,進一步探討IL-1β參與角膜移植免疫排斥反應的機制。方法:(1)構建小鼠穿透性角膜移植模型,并隨機分為正常對照組、同系移植組、異系移植組、異系移植并IL-1β中和性抗體處理組。在此基礎上,通過裂隙燈觀察IL-lβ中和性抗體對角膜移植免疫排斥反應的影響;并利用Real-time PCR和Western blot檢測各組小鼠角膜植片中IL-lβ及其受體IL-1R1等的表達水平;免疫熒光分析IL-lβ受體IL-1R1的表達水平及其分布情況。(2)分別利用野生型小鼠和NLRP3缺陷小鼠構建穿透性角膜移植模型,并隨機分為正常對照組、同系移植組和異系移植組。在此基礎上,通過臨床觀察研究干預NLRP3炎癥小體抑制IL-lβ成熟對角膜抑制免疫排斥反應的影響;并進一步利用Western Blot和免疫熒光技術分析角膜移植免疫排斥過程中NLRP3和IL-1β表達水平的變化;使用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測角膜植片中白介素-17(Interleukin-17,IL-17)和干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)的含量。此外,我們還利用NLRP3炎癥小體抑制劑Glubide驗證阻斷NLRP3炎癥小體活化對角膜移植免疫排斥反應的影響。(3)體外無菌分離小鼠骨髓,通過巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor,M-SCF)誘導骨髓源巨 噬細胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)在此基礎上,行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)刺激,并通過Western Blot分析不同組別內(nèi)巨噬細胞中IL-1β表達水平的變化,ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的含量。(4)無菌分離脾細胞,并將其分成空白對照組、IL-6+TGFβl處理組以及IL-6+TGFβl+IL-1β 處理組;同時利用 Anti-CD3(15μg/ml)和 anti-CD28(5μg/ml)刺激96h,通過流式細胞術檢測不同組別細胞中Th17細胞的相對含量,并采用FLLSA檢測不同組別細胞培養(yǎng)上清中IL-17的含量。(5)構建小鼠穿透性角膜移植模型,隨機分為異系移植組、異系移植并IL-17抗體治療組。在此基礎上,通過臨床觀察評估IL-17中和性抗體對角膜移植免疫排斥反應的影響;通過蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)評估不同組別角膜植片的病理改變。結果:(1)與同系移植組相比較,異系移植組小鼠角膜植片中的IL-1β mRNA水平明顯著增加;Western blot結果顯示:活化形式的IL-1β在異系移植組中的水平明顯高于同系移植組。同時,IL-1β受體IL-1R1的表達水平在角膜免疫排斥過程中也顯著增強,且廣泛表達于發(fā)生免疫排斥小鼠角膜植片的上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層。IL-1β中和實驗表明IL-1β中和性抗體可顯著延長角膜植片的存活時間。以上結果提示IL-1β可促進角膜移植免疫排斥反應的發(fā)生。(2)Western blot結果表明,發(fā)生免疫排斥反應的小鼠角膜植片中NLRP3的表達水平顯著增加,且主要表達于角膜植片的上皮層、基質(zhì)層以及內(nèi)皮層。與對照組相比,利用Glubide抑制NLRP3炎癥小體的活性可明顯延長角膜植片的存活時間,并有效減輕角膜移植排斥反應。與野生型小鼠模型比較,NLRP3缺陷小鼠角膜植片存活時間明顯延長;但向NLRP3缺陷小鼠回輸IL-1β則可明顯促進角膜移植免疫排斥反應的發(fā)生。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn),NLRP3缺陷小鼠角膜植片中IL-17的水平顯著降低,而IFN-γ的水平則沒有顯著變化,提示NLRP3炎癥小體可能通過影響Th17細胞免疫反應參與角膜移植免疫排斥反應。(3)通過BMDM模型發(fā)現(xiàn),與野生型BMDM比較,NLRP3缺陷的BMDM分泌IL-1β的能力顯著下降。通過體外共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),與野生型BMDM培養(yǎng)上清處理組相比較,NLRP3缺陷BMDM培養(yǎng)上清刺激Th17細胞分化的能力顯著下降;ELISA的結果顯示,NLRP3缺陷BMDM培養(yǎng)上清誘導產(chǎn)生的Th17細胞分泌IL-17的能力也明顯下降。上述結果表明IL-1β可促進Th17細胞免疫反應。(4)與對照組相比,IL-17中和性抗體可明顯延長角膜植片存活時間;病理分析結果顯示:IL-17中和性抗體可有效抑制角膜植片炎性細胞浸潤。上述結果表明Th17細胞免疫反應參與角膜移植免疫排斥的病理過程。結論:(1)角膜移植免疫排斥過程中,角膜植片中IL-1β的表達水平顯著增強,中和IL-1β可延長角膜植片存活時間。(2)角膜移植免疫排斥過程中,角膜植片中的NLRP3表達水平明升高,通過干預NLRP3炎癥小體抑制IL-1β的成熟可有效抑制角膜移植免疫排斥反應。(3)IL-1β通過誘導Th17細胞參與角膜移植免疫排斥反應,中和IL-17可延長角膜植片存活時間。
【圖文】：

圖１ＩＬ－１Ｐ對小鼠角膜移植免疫排斥反應的影響＆邋（Ａ）三姐小鼠角膜移植術后ＩＬ－ｉｐ前體逡逑ＰＣＲ結果；（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測邑組小鼠植片ＩＬ－ｉｐ前體、成熟體及其受體的表達情逡逑況；（Ｃ）免疫熒光檢測三．}D小鼠植片ＩＬ－１Ｐ受體分布情況；ＣＤ）三組小鼠角膜移楦術逡逑后植．片存活曲線，采用Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅ＿ｒ生，存分析ｄ逡逑

３巨噬細胞通過ＩＬ－ｌｐ誘導Ｔｈｌ７細胞分化６邋（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ檢測巨噬細胞上猜中ＩＬ－ｉｐ的逡逑]裕沖危ǎ攏╁澹祝澹螅簦澹潁鑠澹攏歟錚艏歟翰獠患緙壕蓿菏上赴蠇p內(nèi)的ＩＬ－１（３的表，達愉況；（Ｃ）流式術不同培養(yǎng)上＿誘導Ｔｈｌ７細胞的Ｗ分比；（Ｄ邋）邋ＥＬＩＳＡ檢測不：同組別Ｔｈｌ７細胞分泌ＩＬ的含]質(zhì)灣義，

本文編號：2661018