【摘要】：研究背景過敏性鼻炎(Allergic Rhinitis,AR)是最常見的呼吸道炎癥性疾病之一,發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì),其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,無法開發(fā)出有效的精準(zhǔn)治療手段。研究表明DNA水平的甲基化改變和RNA水平的基因表達(dá)異�？赡軈⑴cAR的發(fā)病過程,因此可以借助高通量基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)AR患者潛在的致病性基因及甲基化位點(diǎn),并結(jié)合生物信息學(xué)方法和生物學(xué)手段進(jìn)行分析和驗(yàn)證,從而為AR的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路和理論依據(jù)。研究方法本研究首先選取AR患者(n=19)和非AR患者(n=11)的下鼻甲黏膜組織,通過全基因組甲基化芯片和全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè),分別篩選AR患者中出現(xiàn)的異常甲基化位點(diǎn)和差異性表達(dá)基因;隨后通過Gene Ontology功能富集、KEGG通路富集、聯(lián)合芯片(甲基化和表達(dá)譜)和文獻(xiàn)檢索等方法對(duì)篩選出的基因進(jìn)行綜合分析;最后選取AR患者(n=55)和非AR患者(n=40)的樣本,在mRNA水平和蛋白水平對(duì)表達(dá)譜篩選的部分差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果甲基化芯片發(fā)現(xiàn),AR患者中出現(xiàn)的異常甲基化位點(diǎn)總共為94個(gè);通過Gene Ontology功能富集、KEGG通路富集和聯(lián)合表達(dá)譜芯片分析均未出現(xiàn)陽性結(jié)果,通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)TLR6和IL-4R基因的異常甲基化位點(diǎn)可能與AR的發(fā)病關(guān)系較為密切。表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn),AR患者中出現(xiàn)差異性表達(dá)的基因總共為160個(gè);Gene Ontology分析發(fā)現(xiàn)32條顯著的功能富集,其中20條富集與纖毛結(jié)構(gòu)或功能直接相關(guān);KEGG分析發(fā)現(xiàn)8條顯著的通路富集,其中1條與纖毛結(jié)構(gòu)直接相關(guān)并富集最為顯著;文獻(xiàn)檢索并結(jié)合纖毛結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn),選取以下纖毛功能(FOXJ1)和纖毛結(jié)構(gòu)相關(guān)(DNAI1、DNALI1和DNAH9)的差異性表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的驗(yàn)證后,確認(rèn)了FOXJ1、DNAI1、DNAI1、和DNAH9在AR患者下鼻甲黏膜中表達(dá)下降的現(xiàn)象;隨后通過免疫熒光染色法對(duì)FOXJ1和DNAI1的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)和觀察,并首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了 FOXJ1蛋白的4種定位模式;進(jìn)一步建立評(píng)分機(jī)制并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)FOXJ1和DNAI1的蛋白定位特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)了 AR患者下鼻甲黏膜中出現(xiàn)了顯著升高的FOXJ1和DNAI1蛋白的異常定位改變。結(jié)論本研究對(duì)AR患者下鼻甲黏膜中存在的異常甲基化位點(diǎn)和差異性表達(dá)基因進(jìn)行了篩選,為AR發(fā)病機(jī)制的研究提供了重要線索;纖毛結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)基因表達(dá)下降、蛋白標(biāo)志物的異常定位改變是AR患者下鼻甲黏膜中的重要特征,可能與AR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),未來需要更深入的機(jī)制研究進(jìn)一步證實(shí);本研究中建立了纖毛標(biāo)志物蛋白定位評(píng)分體系,相信能為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供重要的參考價(jià)值。
【圖文】：

過敏原或病原體不能及時(shí)地排出，便可引起反復(fù)的鼻腔鼻竇炎癥［３８］。正常運(yùn)動(dòng)逡逑纖毛由纖毛膜、基質(zhì)和軸絲（Ａｘｏｎｅｍｅ）組成；軸絲的超微結(jié)構(gòu)，呈典型的“９ｘ２＋２”逡逑模型（圖３－１，選自我們課題組尚未發(fā)表的數(shù)據(jù)），包括周圍９組二聯(lián)外周微管逡逑（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ），分別稱Ａ管和Ｂ管，兩者相互間呈緊密連接；相鄰的微管之逡逑間由微管連接蛋白（Ｎｅｘｉｎ－ｄｙｎｅｉｎ邋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｎ－ＤＲＣ）相連；從邋Ａ邋管逡逑伸出兩條動(dòng)力臂結(jié)構(gòu)，分別稱為外動(dòng)力臂（Ｏｕｔｅｒ邋ｄｙｎｅｉｎ邋ａｒｍ）和內(nèi)動(dòng)力臂（Ｉｎｎｅｒ逡逑ｄｙｎｅｉｎ邋ａｒｍ）；外周微管環(huán)繞著兩條單獨(dú)分開的微管結(jié)構(gòu)，為中央微管（Ｃｅｎｔｒａｌ逡逑ｐａｉｒ）。外周微管和中央微管間由放射狀的輻條結(jié)構(gòu)（Ｒａｄｉａｌ邋ｓｐｏｋｅ）相連接［３９］。逡逑纖毛的動(dòng)力臂結(jié)構(gòu)包括動(dòng)力蛋白重鏈（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌ邋ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ，ＤＮＡＨ），逡逑動(dòng)力蛋白中間鏈（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌ邋ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ邋ｃｈａｉｎ，邋ＤＮＡＩ）和動(dòng)力蛋白輕鏈逡逑（Ｄｙｎｅｉｎ邋ａｘｏｎｅｍａｌｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ，，ＤＮＡＬ），這些結(jié)構(gòu)是組成纖毛動(dòng)力臂的重要成逡逑分蛋白［４（）］

Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑３．３．２．５鼻腔細(xì)胞離心涂片樣本的制備逡逑１）活檢鼻腔下鼻甲組織樣本后，通過使用ｌ0ｍｇ邋／邋ｍＬ邋Ｄｉｓｐａｓｅ邋ＩＩ逡逑（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）在邋４°Ｃ過夜，然后在邋３７°Ｃ下用邋１３Ｔｉｔｐ－ｓｐｉｎ／ＥＤＴＡ逡逑處理１５分鐘，隨后使用ｌｍｌ量程移液器來調(diào)整至最大量程后進(jìn)行吹打，盡可能逡逑將單細(xì)胞懸浮液與新鮮鼻活檢樣品解離；逡逑２）將解離的細(xì)胞在室溫下４％多聚甲醛固定液中固定１０分鐘后離心逡逑（１２００ｒｐｍ，５ｍｉｎ），卩及取上清液后，沉淀中加入ｌｘＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ液緩慢吹打逡逑并靜置１０分鐘，兩次并離心（１２００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）；逡逑３）最后，通過使用細(xì)胞離心涂片機(jī)【Ｓｈａｎｄｏｎ邋Ｃｙｔｏｓｐｉｎ邋３邋Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ逡逑（Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；邋Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｆｉｓｃｈｅｒ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，邋ＭＡ）】，在溫和加速下逡逑以５００ｒｐｍ轉(zhuǎn)速５ｍｉｎ制備ｃｙｔｏｓｐｉｎ邋（每張載玻片１－２＞＜１0４個(gè)細(xì)胞）玻片，錫紙密逡逑閉后保存于－２０°Ｃ冰箱中。逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R765.21

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本文編號(hào)：2659280