【摘要】：目的:恢復(fù)STGC3基因在鼻咽癌CNE2細(xì)胞高表達(dá),分析CNE2細(xì)胞對(duì)X射線敏感性,探討可能增敏分子機(jī)制。方法:1.構(gòu)建RTP-STGC3-his慢病毒表達(dá)載體,感染CNE2細(xì)胞,建立CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞系。2.實(shí)驗(yàn)分為兩組,(1)照射組:CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞(轉(zhuǎn)STGC3基因)、CNE2-RTP-his細(xì)胞(轉(zhuǎn)空載體)及CNE2組,以6MV X線照射2分鐘,總劑量為4Gy。(2)未照射組:CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞(轉(zhuǎn)STGC3基因)、CNE2-RTP-his細(xì)胞(轉(zhuǎn)空載體)及CNE2組,3.采用CCK-8方法,檢測(cè)受照射細(xì)胞的活力。4.使用Transwell實(shí)驗(yàn),檢測(cè)受照射細(xì)胞遷移侵襲能力。5.應(yīng)用SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析,檢測(cè)受照射細(xì)胞蛋白表達(dá)差異。6.施用Western Blot方法,驗(yàn)證受照射細(xì)胞部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子,以及LC3、p62、p-S6和p-ULK1自噬相關(guān)蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平。結(jié)果:1.成功建立CNE2-RTP-STGC3-his及CNE2-RTP-his細(xì)胞系,STGC3基因在CNE2-RTP-STGC3-his高表達(dá)(課題前期完成)。紅色熒光蛋白(RFP)檢測(cè),熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)RFP表達(dá),轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)空載體組細(xì)胞表達(dá)RFP數(shù)目均80%,Western Blot檢測(cè)結(jié)果,顯示STGC3蛋白CNE2-RTP-STGC3-his穩(wěn)定高表達(dá)(p0.05),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)X線照射,CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞活力,低于CNE2-RTP-his細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)X線照射,CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞遷移侵襲細(xì)胞數(shù)小于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)鑒定、Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)分析,結(jié)果顯示,照射組與未照射組比較,細(xì)胞呈現(xiàn)出14-3-3、TUBA1B及calnexin蛋白質(zhì)分子的表達(dá)水平升高。5.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,照射CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞,14-3-3和自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)水平降低(p0.05),p62、p-S6及p-ULK1表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.STGC3基因在CNE2細(xì)胞高表達(dá),增強(qiáng)放療敏感性,其機(jī)制可能與抑制自噬有關(guān)。
【圖文】：

期構(gòu)建完成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紅色熒光蛋白（RFP）評(píng)估感染效率。將各組細(xì)胞置于熒光顯微鏡下，觀察 RFP 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，CNE2-RTP-his 細(xì)胞和CNE2-RTP-STGC3-his細(xì)胞內(nèi)RFP表達(dá)，且熒光細(xì)胞數(shù)目＞80%（圖3.1.1）。CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his圖3.1.1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率（×200）b. 提 取 CNE2 （ 空 白 對(duì) 照 組 ） ， CNE2-RTP-his （ 轉(zhuǎn) 空 載 體 組 ） 及CNE2-RTP-STGC3-his（轉(zhuǎn)STGC3基因組）細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中STGC3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，在CNE2-RTP-STGC3-his中，STGC3蛋白穩(wěn)定高表達(dá)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖3.1.2）。

圖3.1.2 Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中STGC3蛋白表達(dá)1：CNE2 2：CNE2-RTP-his 3：CNE2-RTP-STGC3-his*p＜0.05，vs CNE2-RTP-his3.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)照射后各組細(xì)胞活力X 線照射后，，將 CNE2，CNE2-RTP-his，CNE2-RTP-STGC3-his 細(xì)胞分別于0h、4h、24h 加入 CCK-8 試劑，并測(cè)量各組 450nm 處的 OD 值。結(jié)果顯示，CNE2-RTP-STGC3-his 細(xì)胞在照射后 4h,24h 的 OD 值低于 CNE2-RTP-his 細(xì)胞（表3.2.1），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），這表明 STGC3 基因高表達(dá)能降低 X線照射后鼻咽癌 CNE2 細(xì)胞的活力。表3.2.1 CCK-8法測(cè)定OD值（mean±SD, n=6）時(shí)間 CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賀修勝,肖志強(qiáng),陳主初,趙素萍,朱建華,賀智敏,李友軍,田芳,余艷輝;STGC3新基因的克隆及功能初步分析[J];癌癥;2004年10期

本文編號(hào)：2627501