【摘要】：目的:恢復STGC3基因在鼻咽癌CNE2細胞高表達,分析CNE2細胞對X射線敏感性,探討可能增敏分子機制。方法:1.構(gòu)建RTP-STGC3-his慢病毒表達載體,感染CNE2細胞,建立CNE2-RTP-STGC3-his細胞系。2.實驗分為兩組,(1)照射組:CNE2-RTP-STGC3-his細胞(轉(zhuǎn)STGC3基因)、CNE2-RTP-his細胞(轉(zhuǎn)空載體)及CNE2組,以6MV X線照射2分鐘,總劑量為4Gy。(2)未照射組:CNE2-RTP-STGC3-his細胞(轉(zhuǎn)STGC3基因)、CNE2-RTP-his細胞(轉(zhuǎn)空載體)及CNE2組,3.采用CCK-8方法,檢測受照射細胞的活力。4.使用Transwell實驗,檢測受照射細胞遷移侵襲能力。5.應(yīng)用SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析,檢測受照射細胞蛋白表達差異。6.施用Western Blot方法,驗證受照射細胞部分差異表達蛋白質(zhì)分子,以及LC3、p62、p-S6和p-ULK1自噬相關(guān)蛋白質(zhì)分子的表達水平。結(jié)果:1.成功建立CNE2-RTP-STGC3-his及CNE2-RTP-his細胞系,STGC3基因在CNE2-RTP-STGC3-his高表達(課題前期完成)。紅色熒光蛋白(RFP)檢測,熒光顯微鏡下細胞內(nèi)可見RFP表達,轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)空載體組細胞表達RFP數(shù)目均80%,Western Blot檢測結(jié)果,顯示STGC3蛋白CNE2-RTP-STGC3-his穩(wěn)定高表達(p0.05),用于后續(xù)實驗。2.CCK-8實驗結(jié)果顯示,經(jīng)X線照射,CNE2-RTP-STGC3-his細胞活力,低于CNE2-RTP-his細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。3.Transwell實驗結(jié)果顯示,經(jīng)X線照射,CNE2-RTP-STGC3-his細胞遷移侵襲細胞數(shù)小于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4.SDS-PAGE電泳、蛋白質(zhì)鑒定、Mascot數(shù)據(jù)庫分析,結(jié)果顯示,照射組與未照射組比較,細胞呈現(xiàn)出14-3-3、TUBA1B及calnexin蛋白質(zhì)分子的表達水平升高。5.Western Blot檢測結(jié)果顯示,照射CNE2-RTP-STGC3-his細胞,14-3-3和自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達水平降低(p0.05),p62、p-S6及p-ULK1表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:1.STGC3基因在CNE2細胞高表達,增強放療敏感性,其機制可能與抑制自噬有關(guān)。
【圖文】：

期構(gòu)建完成。本實驗通過紅色熒光蛋白（RFP）評估感染效率。將各組細胞置于熒光顯微鏡下，觀察 RFP 的表達情況。結(jié)果顯示，CNE2-RTP-his 細胞和CNE2-RTP-STGC3-his細胞內(nèi)RFP表達，且熒光細胞數(shù)目＞80%（圖3.1.1）。CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his圖3.1.1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率（×200）b. 提 取 CNE2 （ 空 白 對 照 組 ） ， CNE2-RTP-his （ 轉(zhuǎn) 空 載 體 組 ） 及CNE2-RTP-STGC3-his（轉(zhuǎn)STGC3基因組）細胞總蛋白，通過Western Blot檢測各組細胞中STGC3蛋白的表達。結(jié)果顯示，在CNE2-RTP-STGC3-his中，STGC3蛋白穩(wěn)定高表達，用于后續(xù)實驗（圖3.1.2）。

圖3.1.2 Western Blot檢測各組細胞中STGC3蛋白表達1：CNE2 2：CNE2-RTP-his 3：CNE2-RTP-STGC3-his*p＜0.05，vs CNE2-RTP-his3.2 CCK-8 實驗檢測照射后各組細胞活力X 線照射后，，將 CNE2，CNE2-RTP-his，CNE2-RTP-STGC3-his 細胞分別于0h、4h、24h 加入 CCK-8 試劑，并測量各組 450nm 處的 OD 值。結(jié)果顯示，CNE2-RTP-STGC3-his 細胞在照射后 4h,24h 的 OD 值低于 CNE2-RTP-his 細胞（表3.2.1），差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），這表明 STGC3 基因高表達能降低 X線照射后鼻咽癌 CNE2 細胞的活力。表3.2.1 CCK-8法測定OD值（mean±SD, n=6）時間 CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賀修勝,肖志強,陳主初,趙素萍,朱建華,賀智敏,李友軍,田芳,余艷輝;STGC3新基因的克隆及功能初步分析[J];癌癥;2004年10期

本文編號：2627501