發(fā)布時間：2020-04-01 01:43

【摘要】：研究目的甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)又名Graves眼病、甲狀腺功能亢進突眼、內(nèi)分泌眼病等,是graves病在甲狀腺以外的表現(xiàn),屬于自身免疫性器官特異性疾病。大量研究認為,促甲狀腺激素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)和胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)是TAO的自身抗原,兩者形成結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)合體,在TAO發(fā)病的分子機制中起至關(guān)重要的作用,但其余分子是否亦在TAO的病程中扮演重要角色,目前仍不清楚。本文第一部分采用第二代高通量測序中的轉(zhuǎn)錄組測序的方法,對甲狀腺相關(guān)眼病患者和健康對照人群來源的眼眶脂肪結(jié)締組織中的轉(zhuǎn)錄組信息進行提取和分析,探討除TSHR和IGF-1R以外,其余可能參與TAO疾病發(fā)生發(fā)展的分子和信號通路�；谵D(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果,穿透素-3(Pentraxin-3,PTX3)在甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶脂肪結(jié)締組織中的表達高于健康對照組來源的眼眶脂肪結(jié)締組織。PTX3屬于長鏈穿透素家族,該家族還包括C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和血清P蛋白(serum amyloid P component,SAP)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等其他自身免疫性炎癥性疾病中,PTX3在疾病極早期就有較高濃度表達,靈敏度高于CRP和SAP,且PTX3在血清中的表達值與疾病的嚴重程度呈正相關(guān),對疾病的預(yù)后有重要的啟示作用。本課題組在之前的研究中發(fā)現(xiàn),甲狀腺刺激激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以作用于纖維細胞(Fibrocytes,Fc),刺激其高表達PTX3,這種效應(yīng)是通過增加PTX3的mRNA穩(wěn)定性達到的,且可以被抗炎藥物和抗IGF-1R藥物所阻斷。本文第二部分計劃在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,取TAO患者和健康人來源的眼眶脂肪結(jié)締組織和血清樣本,比較不同來源的組織和血清中PTX3的表達差異,探討PTX3作為TAO潛在生物學(xué)標志物的可能性。日前,一項多中心、雙盲、平行隨機對照的臨床試驗證實了抗IGF-1R抗體teprotumumab對于TAO治療的有效性和安全性,改變了TAO目前治療局限于對癥治療的窘境。但teprotumumab產(chǎn)生作用的分子機制仍在進一步探索中。本文第三部分計劃采用teprotumumab處理共培養(yǎng)的纖維細胞和Th1細胞,并用PMA等抗原加以刺激,觀察II類主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,class II,MHCⅡ)和干擾素伽馬(Interferon-γ,IFN-γ)的表達量變化等,了解teprotumumab對于纖維細胞抗原呈遞作用和Th1細胞活化的影響及機制。研究方法1.對納入的對照組和病例組眼眶脂肪結(jié)締組織進行mRNA質(zhì)量檢測;符合要求的樣本各5例進一步采用RNA測序(RNA sequencing,RNA-seq)獲得其轉(zhuǎn)錄組信息,得到原始數(shù)據(jù)Rawdata;2.對Rawdata進行基因表達定量和校正,得到兩組間差異表達的基因Dif-gene;3.對Dif-gene進行基因本體分析(Gene Ontology Analysis,GO)和通路分析;4.根據(jù)得到的顯著性GO條目,做功能樹分析(GO-tree)。根據(jù)顯著性信號通路做信號通路網(wǎng)絡(luò)(Path-Act-Network)構(gòu)建;5.選取表達豐度高、差異倍數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義的上調(diào)基因和下調(diào)基因各2個,在TAO患者和健康對照人群眼眶脂肪結(jié)締組織上,通過Real-time PCR驗證Dif-gene的差異表達。6.分別取TAO患者和健康對照人群眼眶脂肪結(jié)締組織和其培養(yǎng)的成纖維細胞,通過Real-time PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry,IHC)分別驗證PTX3在細胞mRNA和蛋白層面的表達;7.分別取TAO患者和健康對照人群來源的血液樣本,通過酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測樣本中PTX3蛋白的表達;8.分別取TAO患者和健康對照人群來源的血液樣本,在外周血纖維細胞培養(yǎng)環(huán)境中加/不加teprotumumab,通過Real-time PCR和流式細胞技術(shù)分別檢測細胞表面MHCⅡ表達的變化;9.分別取TAO患者和健康對照人群來源的血液樣本,在外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)培養(yǎng)環(huán)境中加/不加teprotumumab,細胞成熟后用P/I抗體加以刺激,流式細胞技術(shù)檢測Th1細胞內(nèi)IFN-γ產(chǎn)量;10.收集上述樣本培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)液,ELISA檢測加/不加teprotumumab時培養(yǎng)液中IFN-γ的表達量;11.分別取TAO患者和健康對照人群來源的血液樣本,在外周血單核細胞培養(yǎng)環(huán)境中加/不加teprotumumab,待細胞成熟后加入IFN-γ中和抗體,流式細胞技術(shù)檢測纖維細胞表面MHCⅡ的表達。結(jié)果1.TAO患者和健康對照人群來源的脂肪結(jié)締組織,轉(zhuǎn)錄組測序得到的原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評分均大于20,mappedrate最低為0.895,最高為0.931。數(shù)據(jù)主要來源于外顯子區(qū)域。轉(zhuǎn)錄組測序共得到784個差異表達基因;2.PTX3等445個基因在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中表達上調(diào)明顯。CTHRC1等339個基因在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中表達下調(diào)明顯。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;3.細胞因子和細胞因子受體相互作用、趨化因子等19條通路在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中上調(diào)明顯;細胞粘附、細胞外基質(zhì)受體等20條通路在TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織中下調(diào)明顯;4.差異表達的基因和信號通路主要涉及以下功能:炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、疤痕修復(fù)、T細胞調(diào)節(jié)等;PTX3基因主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等生物學(xué)過程。5.在TAO患者來源的眼眶脂肪結(jié)締組織中,PTX3在mRNA和蛋白水平表達均高于健康對照人群;6.PTX3在TAO患者來源的血液樣本中,表達高于健康對照人群;但TAO活動期和穩(wěn)定期表達無明顯差異。7.無論是否有抗原刺激,teprotumumab均可降低外周血纖維細胞表面的MHCⅡ基因水平和蛋白水平的表達。且這種效應(yīng)在TAO患者和健康對照人群來源的外周血纖維細胞中均可觀測到;8.Teprotumumab可明顯降低Th1細胞內(nèi)的IFN-γ水平,無論細胞來源于TAO患者或健康對照人群;9.Teprotumumab可明顯降低細胞培養(yǎng)液中IFN-γ的蛋白水平,無論細胞來源于TAO患者或健康對照人群;10.當加入IFN-γ中和抗體處理后,外周血纖維細胞表面MHCⅡ的表達明顯降低,且這種效應(yīng)在TAO患者和健康對照人群來源的外周血纖維細胞中均可觀測到。結(jié)論1.PTX3等基因可能與TAO的發(fā)生和進展過程相關(guān)。細胞因子和細胞因子受體相互作用、趨化因子通路可能參與了TAO的病理過程;TAO患者的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、疤痕修復(fù)、T細胞免疫活性等生物學(xué)過程增強。多種炎癥相關(guān)基因和自身免疫相關(guān)基因在TAO患者來源的眼眶脂肪結(jié)締組織中表達升高,再次證實TAO與自身免疫、炎癥的相關(guān)性;2.炎性分子PTX3在TAO患者的眼眶脂肪結(jié)締組織和血液中表達均增高,可能涉及了TAO的炎性進展過程,PTX3可能是TAO病程診斷和預(yù)后的潛在生物學(xué)標志;3.Th1細胞通過分泌IFN-γ,刺激纖維細胞表面MHCⅡ分子的表達,teprotumumab可減少Th1細胞分泌的IFN-γ并減弱纖維細胞表面MHCⅡ分子的表達;4.Teprotumumab可減弱抗原刺激時Th1細胞的活化效應(yīng),并減弱纖維細胞的抗原呈遞作用,這種效應(yīng)在TAO患者和健康對照人群來源的外周血纖維細胞中沒有明顯差異。說明teprotumumab有效治療TAO的機制,一部分可能是通過減弱Th1細胞和纖維細胞對自身抗體的免疫效應(yīng)來實現(xiàn)的。
【圖文】：

圖 1.1 其中 1 例 TAO 患者來源組織的基因序列質(zhì)量分數(shù)，左圖為質(zhì)量控制前，右圖為質(zhì)量控制后。橫軸表示堿基的位置從第 1 個到第 300 個，縱軸表示質(zhì)量得分。紅色表示中數(shù)，黃色區(qū)域是 25%至 75%區(qū)間，上下極是 10%-90%區(qū)間，藍線是平均數(shù)。圖中該讀段經(jīng)量控制后，1 至 200 堿基質(zhì)量分數(shù)平均值大于 20，表示比對準確度高于 99%，為高質(zhì)量測數(shù)據(jù)，可供后續(xù)分析。10 例樣本的基因序列經(jīng)質(zhì)量控制后，1-200 堿基質(zhì)量分數(shù)平均值均大于 20 分，于高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。人類 DNA 序列由 ATGC 四種堿基組成且 GC 含量保守。正常情況下，四種堿基現(xiàn)的頻率應(yīng)該是接近的，提示測序建庫足夠均勻、數(shù)據(jù)量足夠。如果出現(xiàn)較大偏差，明可能存在樣品污染或部分 reads 構(gòu)成的子集存在偏差等情況。如果接近正態(tài)分布，偏離理論分布，說明可能存在檢測的系統(tǒng)誤差。以上述同一例樣本為例，GC 含量下圖所示：

圖 1.1 其中 1 例 TAO 患者來源組織的基因序列質(zhì)量分數(shù)，左圖為質(zhì)量控制前，右圖質(zhì)量控制后。橫軸表示堿基的位置從第 1 個到第 300 個，縱軸表示質(zhì)量得分。紅色表示數(shù)，黃色區(qū)域是 25%至 75%區(qū)間，上下極是 10%-90%區(qū)間，藍線是平均數(shù)。圖中該讀段量控制后，1 至 200 堿基質(zhì)量分數(shù)平均值大于 20，，表示比對準確度高于 99%，為高質(zhì)量數(shù)據(jù)，可供后續(xù)分析。10 例樣本的基因序列經(jīng)質(zhì)量控制后，1-200 堿基質(zhì)量分數(shù)平均值均大于 20 分于高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。人類 DNA 序列由 ATGC 四種堿基組成且 GC 含量保守。正常情況下，四種堿現(xiàn)的頻率應(yīng)該是接近的，提示測序建庫足夠均勻、數(shù)據(jù)量足夠。如果出現(xiàn)較大偏明可能存在樣品污染或部分 reads 構(gòu)成的子集存在偏差等情況。如果接近正態(tài)分偏離理論分布，說明可能存在檢測的系統(tǒng)誤差。以上述同一例樣本為例，GC 含下圖所示：
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R581;R771.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陸燕;魏銳利;;甲狀腺相關(guān)性眼病的免疫學(xué)機制及治療新靶點[J];眼科新進展;2011年01期

本文編號：2609847