【摘要】：目的:研究自噬誘導(dǎo)多肽tat-beclin1在SD大鼠急性高眼壓損傷模型中對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal ganglion cell,RGC)的保護作用,以及初步探討這一保護作用中自噬和凋亡的相互關(guān)系和機制,為青光眼性視神經(jīng)保護提供新的思路。方法:(1)用胰酶消化法分離、體外培養(yǎng)原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞,檢測tat-beclin1對正常原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞以及氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷后細胞活性的影響。(2)選取8周齡SD大鼠,在大鼠右眼行前房灌注無菌0.9%氯化鈉溶液建立大鼠急性高眼壓模型。前房灌注結(jié)束后,在右眼行玻璃體腔注射tat-beclin1(2.5μg)溶液。左眼作為假手術(shù)對照。于再灌注6h、12h、24h、48h、3d、7d后處死大鼠摘取眼球,制作視網(wǎng)膜石蠟切片行HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)改變,行TUNEL染色檢測視網(wǎng)膜各層細胞凋亡的情況。制作視網(wǎng)膜平鋪片利用熒光金(Fluoro-Gold,FG)逆行標記RGCs檢測其數(shù)目變化。取完整視網(wǎng)膜組織行蛋白質(zhì)免疫印跡試驗檢測凋亡執(zhí)行因子cleaved caspase-3以及自噬相關(guān)蛋白beclin1、p62 和 LC3Ⅱ/Ⅰ 的表達。結(jié)果:(1)tat-beclin 1顯著增強正常原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞及氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷后的細胞活性(P0.001)。(2)HE染色顯示急性高眼壓6h和24h視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度增加,3d和7d視網(wǎng)膜內(nèi)層顯著變薄,視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列紊亂,RGCs出現(xiàn)核固縮。Tat-beclin1治療組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與厚度較陰性對照PBS組有所恢復(fù)。視網(wǎng)膜急性高眼壓損傷24h后tat-beclin1組(51.2±4.3個/mm2)TUNEL染色陽性細胞數(shù)量顯著少于陰性對照PBS組(133.2±5.6個/mm2)。FG逆行標記RGCs測得急性高眼壓3d后RGCs的存活率為47.3%±5.4%,tat-beclin1治療組RGCs的存活率為73.0%±3.2%。急性高眼壓24h后,與陰性對照PBS組相比,tat-beclin1治療組視網(wǎng)膜組織中活化型caspase-3(P0.001)的表達顯著下調(diào),且beclin 1與LC3Ⅱ的表達顯著上調(diào),p62表達下調(diào)。結(jié)論:自噬誘導(dǎo)多肽tat-beclin 1對原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞氧糖剝奪/再復(fù)氧損傷以及大鼠視網(wǎng)膜急性高眼壓損傷有修復(fù)保護作用,自噬相關(guān)蛋白的動態(tài)變化提示tat-beclin 1誘導(dǎo)自噬水平上調(diào)對RGCs的凋亡具有抑制作用。
【圖文】：

顯微鏡下觀察可見，細胞剛接種時為圓球狀，接種２小時后，大部分細胞貼逡逑壁。接種２４小時后，細胞基本完全貼壁，單層排列，少量細胞伸出短小的突起。逡逑如圖３．１Ａ所示，接種３－６天后，神經(jīng)細胞突起明顯伸長增多，細胞趨向于聚集逡逑生長且其突起形成相互鏈接，有些呈串珠樣排列，部分細胞突起交織成網(wǎng)狀。７逡逑天后神經(jīng)細胞體積開始變小，１４天后細胞開始逐漸死亡。逡逑本實驗首先觀察自噬誘導(dǎo)多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１對正常原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞逡逑細胞活性的影響。如圖３．１Ｂ所示，２．５ｐＭ、５ｍＭ及ｌＯｕＭｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理２小時逡逑后的ＤＩＶ６（６ｄ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ）神經(jīng)細胞經(jīng)ＣＣＫ－８法檢測顯示細胞活性增強，且５ｐＭ及逡逑ｌ0ＭＭ邋ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理組的神經(jīng)細胞活性與無藥物處理對照組相比較有統(tǒng)計學(xué)差逡逑異（Ｐ＜０．００１）。而經(jīng)ｔａｔ－ｓｃｒａｍｂｌｅｄ處理的神經(jīng)細胞活性較無藥物處理對照組無明顯逡逑變化。逡逑自噬誘導(dǎo)多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１預(yù)處理對氧糖剝奪１小時／再復(fù)氧１小時后的原代逡逑大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的影響如圖３．１Ｃ－Ｄ所示，經(jīng)ＣＣＫ－８法檢測得氧糖剝奪／再逡逑復(fù)氧損傷后的原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的細胞活性明顯減弱且與正常對照組相逡逑比較有統(tǒng)計學(xué)差異（ＰＯ．ＯＯｌ）。２．５ｍＭ及５ｎＭ自噬誘導(dǎo)多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１預(yù)處理對逡逑氧糖剝奪／再復(fù)氧損傷后的原代大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞有顯著的保護作用，ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ逡逑１處理組的細胞活性較氧糖剝奪／再復(fù)氧損傷組的細胞活性明顯增強，且５ｐＭ逡逑ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理組的細胞活性較正常對照組增強且有統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ

３．２自噬誘導(dǎo)多肽Ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)急性高眼壓損傷的逡逑影響逡逑手術(shù)顯微鏡下可見（圖３．２Ａ），生理鹽水灌注開始后，原本淡粉色的大鼠瞳逡逑孔由于生理鹽水灌注導(dǎo)致缺血而變白，維持高眼壓６０分鐘后停止灌注，眼球血逡逑液循環(huán)恢復(fù)。急性高眼壓６ｈ、２４ｈ、３ｄ、７ｄ后處死大鼠，摘取眼球，制作視網(wǎng)膜逡逑石蠟切片并行Ｈ＆Ｅ染色。逡逑視網(wǎng)膜連續(xù)石蠟切片Ｈ＆Ｅ染色結(jié)果如圖３．２邋Ｂ－Ｃ所示，假手術(shù)組的大鼠視逡逑網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)層次清晰分明，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜平整，各層細胞整齊排列，神經(jīng)節(jié)細逡逑胞呈單層排列的六角形細胞，胞核為圓形或橢圓形，，胞核較大；內(nèi)叢狀層為較厚逡逑的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；內(nèi)核層主要由雙極細胞、水平細胞、無長突細胞和Ｍｔｔｌｌｅｒ細逡逑胞的細胞核組成，染色較深；外核層較內(nèi)核層厚，排列更為緊密。逡逑如圖３．２邋Ｄ－Ｅ統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，急性高眼壓損傷６ｈ及２４ｈ后，陰性對照ＰＢＳ逡逑組的大鼠視網(wǎng)膜各層組織出現(xiàn)了明顯的水腫情況
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R775;R774.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 肖春婷;吳瑜瑜;;篩板青光眼性病理及跨篩板壓力差在視神經(jīng)損害中研究進展[J];中國實用眼科雜志;2015年04期

2 匡穎;費儉;;小鼠,模式生物中的“常青樹”[J];自然雜志;2013年06期

本文編號：2609159