【摘要】：目的:研究自噬誘導多肽tat-beclin1在SD大鼠急性高眼壓損傷模型中對視網膜神經節(jié)細胞(Retinal ganglion cell,RGC)的保護作用,以及初步探討這一保護作用中自噬和凋亡的相互關系和機制,為青光眼性視神經保護提供新的思路。方法:(1)用胰酶消化法分離、體外培養(yǎng)原代大鼠視網膜神經細胞,檢測tat-beclin1對正常原代大鼠視網膜神經細胞以及氧糖剝奪/再復氧損傷后細胞活性的影響。(2)選取8周齡SD大鼠,在大鼠右眼行前房灌注無菌0.9%氯化鈉溶液建立大鼠急性高眼壓模型。前房灌注結束后,在右眼行玻璃體腔注射tat-beclin1(2.5μg)溶液。左眼作為假手術對照。于再灌注6h、12h、24h、48h、3d、7d后處死大鼠摘取眼球,制作視網膜石蠟切片行HE染色觀察視網膜形態(tài)學改變,行TUNEL染色檢測視網膜各層細胞凋亡的情況。制作視網膜平鋪片利用熒光金(Fluoro-Gold,FG)逆行標記RGCs檢測其數(shù)目變化。取完整視網膜組織行蛋白質免疫印跡試驗檢測凋亡執(zhí)行因子cleaved caspase-3以及自噬相關蛋白beclin1、p62 和 LC3Ⅱ/Ⅰ 的表達。結果:(1)tat-beclin 1顯著增強正常原代大鼠視網膜神經細胞及氧糖剝奪/再復氧損傷后的細胞活性(P0.001)。(2)HE染色顯示急性高眼壓6h和24h視網膜內層厚度增加,3d和7d視網膜內層顯著變薄,視網膜各層結構排列紊亂,RGCs出現(xiàn)核固縮。Tat-beclin1治療組的視網膜結構與厚度較陰性對照PBS組有所恢復。視網膜急性高眼壓損傷24h后tat-beclin1組(51.2±4.3個/mm2)TUNEL染色陽性細胞數(shù)量顯著少于陰性對照PBS組(133.2±5.6個/mm2)。FG逆行標記RGCs測得急性高眼壓3d后RGCs的存活率為47.3%±5.4%,tat-beclin1治療組RGCs的存活率為73.0%±3.2%。急性高眼壓24h后,與陰性對照PBS組相比,tat-beclin1治療組視網膜組織中活化型caspase-3(P0.001)的表達顯著下調,且beclin 1與LC3Ⅱ的表達顯著上調,p62表達下調。結論:自噬誘導多肽tat-beclin 1對原代大鼠視網膜神經細胞氧糖剝奪/再復氧損傷以及大鼠視網膜急性高眼壓損傷有修復保護作用,自噬相關蛋白的動態(tài)變化提示tat-beclin 1誘導自噬水平上調對RGCs的凋亡具有抑制作用。
【圖文】：

顯微鏡下觀察可見，細胞剛接種時為圓球狀，接種２小時后，大部分細胞貼逡逑壁。接種２４小時后，細胞基本完全貼壁，單層排列，少量細胞伸出短小的突起。逡逑如圖３．１Ａ所示，接種３－６天后，神經細胞突起明顯伸長增多，細胞趨向于聚集逡逑生長且其突起形成相互鏈接，有些呈串珠樣排列，部分細胞突起交織成網狀。７逡逑天后神經細胞體積開始變小，１４天后細胞開始逐漸死亡。逡逑本實驗首先觀察自噬誘導多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１對正常原代大鼠視網膜神經細胞逡逑細胞活性的影響。如圖３．１Ｂ所示，２．５ｐＭ、５ｍＭ及ｌＯｕＭｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理２小時逡逑后的ＤＩＶ６（６ｄ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ）神經細胞經ＣＣＫ－８法檢測顯示細胞活性增強，且５ｐＭ及逡逑ｌ0ＭＭ邋ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理組的神經細胞活性與無藥物處理對照組相比較有統(tǒng)計學差逡逑異（Ｐ＜０．００１）。而經ｔａｔ－ｓｃｒａｍｂｌｅｄ處理的神經細胞活性較無藥物處理對照組無明顯逡逑變化。逡逑自噬誘導多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１預處理對氧糖剝奪１小時／再復氧１小時后的原代逡逑大鼠視網膜神經細胞的影響如圖３．１Ｃ－Ｄ所示，經ＣＣＫ－８法檢測得氧糖剝奪／再逡逑復氧損傷后的原代大鼠視網膜神經細胞的細胞活性明顯減弱且與正常對照組相逡逑比較有統(tǒng)計學差異（ＰＯ．ＯＯｌ）。２．５ｍＭ及５ｎＭ自噬誘導多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１預處理對逡逑氧糖剝奪／再復氧損傷后的原代大鼠視網膜神經細胞有顯著的保護作用，ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ逡逑１處理組的細胞活性較氧糖剝奪／再復氧損傷組的細胞活性明顯增強，且５ｐＭ逡逑ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１處理組的細胞活性較正常對照組增強且有統(tǒng)計學差異（Ｐ

３．２自噬誘導多肽Ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１對視網膜組織結構急性高眼壓損傷的逡逑影響逡逑手術顯微鏡下可見（圖３．２Ａ），生理鹽水灌注開始后，原本淡粉色的大鼠瞳逡逑孔由于生理鹽水灌注導致缺血而變白，維持高眼壓６０分鐘后停止灌注，眼球血逡逑液循環(huán)恢復。急性高眼壓６ｈ、２４ｈ、３ｄ、７ｄ后處死大鼠，摘取眼球，制作視網膜逡逑石蠟切片并行Ｈ＆Ｅ染色。逡逑視網膜連續(xù)石蠟切片Ｈ＆Ｅ染色結果如圖３．２邋Ｂ－Ｃ所示，假手術組的大鼠視逡逑網膜組織結構層次清晰分明，視網膜內界膜平整，各層細胞整齊排列，神經節(jié)細逡逑胞呈單層排列的六角形細胞，胞核為圓形或橢圓形，，胞核較大；內叢狀層為較厚逡逑的致密網狀結構；內核層主要由雙極細胞、水平細胞、無長突細胞和Ｍｔｔｌｌｅｒ細逡逑胞的細胞核組成，染色較深；外核層較內核層厚，排列更為緊密。逡逑如圖３．２邋Ｄ－Ｅ統(tǒng)計學結果顯示，急性高眼壓損傷６ｈ及２４ｈ后，陰性對照ＰＢＳ逡逑組的大鼠視網膜各層組織出現(xiàn)了明顯的水腫情況
【學位授予單位】：廈門大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R775;R774.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 肖春婷;吳瑜瑜;;篩板青光眼性病理及跨篩板壓力差在視神經損害中研究進展[J];中國實用眼科雜志;2015年04期

2 匡穎;費儉;;小鼠,模式生物中的“常青樹”[J];自然雜志;2013年06期

本文編號：2609159