【摘要】：目的:erl(erlong,erl)小鼠是在C57BL/6J小鼠背景基礎(chǔ)上,新近篩選制備的研究非綜合征常染色體隱性遺傳性耳聾(DFNB12)的模型小鼠。erl是鈣粘蛋白23基因新發(fā)現(xiàn)的等位基因位點(diǎn),該基因突變導(dǎo)致CDH23蛋白第一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(CDH23EC1)氨基酸發(fā)生替換(S47P),引起CDH23蛋白二級結(jié)構(gòu)如a-螺旋、β-折疊等的改變,影響蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的組成。本課題旨在研究CDH23鈣黏蛋白氨基端前兩個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(EC1+2)的鈣離子結(jié)合性能,探討erl小鼠聽力損害的可能機(jī)制。方法:本研究利用基因工程技術(shù),在大腸桿菌中表達(dá)erl小鼠CDH23的前兩個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域,進(jìn)一步鑒定該重組蛋白與Ca2+結(jié)合性能的改變。在體外分別合成來自野生型和erl小鼠的CDH23EC1+2的DNA序列,并將其克隆到pBV220質(zhì)粒中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,通過溫度誘導(dǎo)的方式(從30℃升高至42℃)誘導(dǎo)CDH23EC1+2在大腸桿菌中表達(dá)。用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析重組蛋白,并用Western Blot鑒定其抗原性。用8M尿素溶解包涵體,通過離子交換層析和凝膠過濾層析純化蛋白,并在含有0.1%sarkosy1的透析液中通過透析復(fù)性的方法使其再折疊。采用Mag-Fluo4 Ca2+熒光探針和Ca2+依賴性的胰蛋白酶水解保護(hù)實(shí)驗(yàn)鑒定重組蛋白CDH23 EC1+2的Ca2+結(jié)合性能。結(jié)果:重組質(zhì)粒中的插入片段與預(yù)期的大小及序列一致,重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)于大腸桿菌,具有抗原性。將包涵體變性、復(fù)性后,用圓二色譜法(CD)進(jìn)一步證實(shí)了重組蛋白的二級結(jié)構(gòu)。Mag-Fluo4 Ca2+熒光探針和Ca2+依賴性的胰蛋白酶水解保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明,與野生型CDH23EC1+2相比,來自erl小鼠的CDH23EC1+2的Ca2+結(jié)合能力減弱。結(jié)論:Ca2+依賴性蛋白質(zhì)相互作用的損害可能參與erl小鼠漸進(jìn)性聽力損失的發(fā)生發(fā)展過程。該結(jié)果有助于進(jìn)一步揭示DFNB12聽力損失的機(jī)制。
【圖文】：

邐濱州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文材料和方法逡逑一、實(shí)驗(yàn)材料逡逑（ ）細(xì)菌菌株與質(zhì)粒逡逑１．細(xì)菌菌株：￡．ｃｏ／／Ｄ／／５ｏ，本實(shí)驗(yàn)室保存�；蛐停海樱眨穑牛矗矗粒欤幔悖眨保叮瑰澹ǎ悖穑福板澹保铃澹停保担╁澹瑁螅洌遥保罚颍澹悖粒戾澹澹睿洌粒戾澹纾颍粒梗跺澹簦瑁椋卞澹颍澹欤粒戾义希玻|(zhì)粒載體：ｐＵＣ５７：長度為２７１０ｂｐ，含一個(gè)８０ｂｐ多克隆酶切位點(diǎn)、ｐ－半苷酶（ＬａｃＺ）基因插入失活、氨芐青霉素（Ａｍｐ）抗性位點(diǎn)等（圖１－１）。逡逑ｆＣ００１０９（邋２６９８邋Ｐｆｏ＼邋４６邋Ｓｓ／ＡＰＩ邋１７９逡逑

ＬＢ培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期ＯＤ６００＝００．６左右，轉(zhuǎn)入４２°Ｃ，劇烈震蕩培養(yǎng)６ｈ。逡逑每隔１小時(shí)取出１．５ｍＬ菌液，５０００ｇ離心５ｍｉｎ，棄去培養(yǎng)液。將不同時(shí)間段誘導(dǎo)菌液逡逑樣品進(jìn)行１２％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝膠電泳，，４ｈ目的蛋白表達(dá)量達(dá)最高峰。（圖４）逡逑（Ａ）邐（Ｂ）逡逑ｕａ邋１２３４５６７８邋ｋＤａ邋１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８逡逑１８０—．邐一邋一￣邋…１８０邋—邋：—邋—邋－ｒｒ．邋—１邋￣邋—邋ＺＩＩ邋—逡逑７�！�，ｔｉｉ篇憸灥曑逡逑２５邋一，墨Ｉｆ２５－：灄W曑－逡逑—ｒｉｒｔｌ．５—邋曑，逡逑圖４．不同時(shí)間誘導(dǎo)的ＣＤＨ２３ＥＣ１＋２（ＷＴ）、（Ｍ）的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結(jié)果逡逑（八）１列：蛋白１１１耵１？１＇；２列：未誘導(dǎo)的（：辦２３及：１＋２（識�。┲校窷B２２０－￡＞／／５￡７；３－８列：（＾；２２３￡＜：丨＋２逡逑（ＷＴ）／ｐＢＶ２２０－邋Ｄ／／５ｏ分別誘導(dǎo)邋１邋ｈ，邋２邋ｈ，邋３邋ｈ，邋４邋ｈ，邋５邋ｈ，邋６邋ｈ．邋（Ｂ）〗列：蛋白邋ｍａｒｋｅｒ；邋２邋列：未誘導(dǎo)的逡逑３－８邋列：Ｑ／Ｗ３儀：ｌ＋２邋（Ｍ）／ｐＢＶ２２０－Ｄ／／５ｏ分別誘導(dǎo)邋ｌｈ，邋２ｈ，邋３ｈ，逡逑４ｈ
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R764.43

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本文編號：2608899