【摘要】：第一部分HUC-MSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定目的:體外分離、培養(yǎng)及鑒定人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs),為HUCMSCs治療小鼠Neu性變應(yīng)性鼻炎模型做前期準(zhǔn)備。方法:1.HUC-MSCs的分離、培養(yǎng):無(wú)菌條件下,將新鮮臍帶組織用D-Hanks緩沖液反復(fù)沖洗,剔除動(dòng)、靜脈和外膜等組織,剪碎至約1mm~3大小組織塊,用胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞沉淀均勻接種于培養(yǎng)瓶中,加入完全培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)依次予4h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,24h后添加培養(yǎng)基,3d半量換液一次。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶底約80%時(shí),按照2:1比例進(jìn)行傳代,保存P3-P4代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.HUC-MSCs的鑒定:檢測(cè)P3代細(xì)胞表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物(CD34,CD45,CD73,CD90,CD105,HLA-DR)表達(dá)情況。同時(shí)進(jìn)行P3代細(xì)胞成骨、成脂及成軟骨分化能力。成骨誘導(dǎo):第20d后觀察有無(wú)鈣結(jié)節(jié)出現(xiàn),用茜素紅染色鑒定成骨分化潛能。成脂誘導(dǎo):第15d后觀察有無(wú)脂滴出現(xiàn),用油紅O鑒定成脂分化潛能;成軟骨誘導(dǎo):第25d后觀察細(xì)胞團(tuán)塊致密情況,用阿新藍(lán)染色鑒定成軟骨分化能力。結(jié)果:1.倒置顯微鏡下形態(tài):細(xì)胞生長(zhǎng)均勻,形態(tài)呈紡錘形,連續(xù)傳代10次以上形態(tài)無(wú)明顯改變、細(xì)胞無(wú)衰老跡象。2.HUCMSCs細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD34,CD45,CD73,CD90,CD105,HLA-DR表達(dá)率分別是0.12,0.17,99.93,99.83,99.77,0.09,符合HUC-MSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)。成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分別能觀察到鐵銹紅色鈣結(jié)節(jié)、脂滴紅染、深藍(lán)色細(xì)胞團(tuán)塊。結(jié)論:HUC-MSCs能通過(guò)貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)出純度較高具有多向分化能力的細(xì)胞。第二部分Neu性變應(yīng)性鼻炎小鼠模型的建立以及HUC-MSCs調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體a表達(dá)的效應(yīng)觀察目的:建立卵清蛋白(OVA)聯(lián)合脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞(Neutrophils,Neu)性小鼠變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型,觀察HUC-MSCs對(duì)AR模型(1)行為學(xué)指標(biāo),(2)細(xì)胞因子,(3)鼻粘膜組織上皮細(xì)胞(nasal epithelial cells,NECs)糖皮質(zhì)激素受體a(Glucocorticoid receptor alpha,GRa)的影響,研究OVA聯(lián)合LPS能建立中性粒細(xì)胞Neu性小鼠AR模型,抑制GRa核轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素抵抗(Glucocorticoid resistance,GR),證實(shí)HUC-MSCs通過(guò)提高GRa核轉(zhuǎn)錄功能對(duì)AR模型起到治療作用。方法:1.Neu性AR小鼠模型的建立:將BALB/c雌性小鼠用無(wú)卵清蛋白脫敏喂養(yǎng)4周后在第1d,7d,14d予腹腔注射卵清蛋白(OVA)予基礎(chǔ)致敏后,在22d-28d內(nèi)每天一次行滴鼻OVA+LPS激發(fā)。每天滴鼻結(jié)束后觀察30min流涕、撓鼻及噴嚏情況并記錄。29d處死小鼠收集鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid,NLF)及鼻組織標(biāo)本,觀察鼻粘膜組織病理改變、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)水平變化。2.HUC-MSCs對(duì)AR模型的治療:將AR造模小鼠分為AR+HUC-MSCs+Dex(MSCs治療組),AR+Dex(地塞米松治療組)和OVA+Dex(對(duì)照組)。在基礎(chǔ)致敏結(jié)束后,MSCs治療組和Dex治療組分別予HUC-MSCs懸液(細(xì)胞數(shù)量1×10~6)尾靜脈注射和Dex(1mg/ml)腹腔注射隔天一次,連續(xù)3次。觀察各組小鼠的行為學(xué)變化,滴鼻激發(fā)致敏結(jié)束后處死小鼠收集NLF及鼻粘膜標(biāo)本,觀察鼻粘膜組織病理改變、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)及NECs胞漿、胞核GRa表達(dá)情況及蛋白水平的檢測(cè)。結(jié)果:予LPS聯(lián)合OVA造模與OVA造模比較,均能出現(xiàn)明顯流涕、撓鼻及噴嚏情況,鼻粘膜病理結(jié)果表明鼻粘膜嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophil,Eos)及Neu浸潤(rùn)明顯,NLF細(xì)胞計(jì)數(shù)Eos及Neu明顯增多,IL-4、IL-17水平上調(diào),IFN-γ水平下降,血清Ig E水平升高,Dex干預(yù)下GRa不能從胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至胞核。HUC-MSCs治療Nue性AR模型后行為評(píng)分明顯改善,降低Eos、Neu、Ig E、IL-4、IL-17水平,胞核GRa水平升高。結(jié)論:LPS聯(lián)合OVA連續(xù)滴鼻激發(fā)可以成功構(gòu)建Neu性小鼠AR模型,且造成對(duì)GRa核轉(zhuǎn)位障礙所致的Dex治療的糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)不敏感;HUC-MSCs可以通過(guò)改善GRa核轉(zhuǎn)位障礙提高Dex的作用,起到治療對(duì)激素不敏感的的Neu性AR的作用。第三部分HUC-MSCs調(diào)控人鼻粘膜上皮細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響及機(jī)制研究目的:研究體外LPS聯(lián)合OVA誘導(dǎo)人鼻粘膜上皮細(xì)胞(Human nasal epithelial cells,HNECs)GRa和糖皮質(zhì)激素受體β(Glucocorticoid receptor beta,GRβ)及IL-4和IL-17的變化,證實(shí)HUC-MSCs通過(guò)旁分泌作用降低IL-17水平改善GRa、GRβ比例失調(diào)糾正GRa、GRβ比例失調(diào),從而改善激素抵抗。方法:1.將HNECs根據(jù)干預(yù)手段分組如下:OVA組;OVA組+LPS組;OVA組+LPS+Dex組;OVA組+Dex組;采用免疫熒光檢測(cè)GRa、GRβ的表達(dá)部位,收集各組細(xì)胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白檢測(cè),上清液IL-4、IL-17的檢測(cè)。2.將HNECs根據(jù)添加細(xì)胞因子不同分組如下:IL-4;IL-17組。采用免疫熒光檢測(cè)GRa、GRβ的表達(dá)部位,收集各組細(xì)胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白檢測(cè)。3.HUC-MSCs與HNECs采用Transwell共培養(yǎng),根據(jù)添加干預(yù)因子不同分組如下:OVA組+LPS組;OVA組+LPS+Dex組;OVA+LPS+HUC-MSCs+Dex組;OVA組+LPS組+IL-17;OVA組+LPS+IL-17+Dex組;OVA+LPS+IL-17+HUC-MSCs采用免疫熒光檢測(cè)GRa、GRβ的表達(dá)部位,收集各組細(xì)胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白檢測(cè)。結(jié)果:OVA聯(lián)合LPS刺激HNECs后,GRa的的m RNA及蛋白水平下降,GRβ的m RNA及蛋白水平升高,分泌IL-4、IL-17增多,與HUC-MSCs共培養(yǎng)后,OVA+LPS干預(yù)下的HNECs的GRβ的m RNA及蛋白水平下降,IL-17干預(yù)下的HNECs的GRβ的m RNA及蛋白水平上升,HUC-MSCs干預(yù)后,GRβ的m RNA及蛋白水平下調(diào)。結(jié)論:HUC-MSCs對(duì)OVA+LPS誘導(dǎo)下的HNECs的GRa與GRβ比例失衡有糾正作用,能降低GRβ水平,IL-17是HNECs GRa與GRβ比例失衡的重要細(xì)胞因子;HUC-MSCs可能通過(guò)旁分泌某種細(xì)胞因子拮抗IL-17作用降低HNECs的GRβ表達(dá),達(dá)到糾正GR表達(dá)異常的作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R765.21

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊影;李春林;羅t，

本文編號(hào)：2595862