【摘要】： 背景鼻咽癌流行于中國南方。低分化型是鼻咽癌最常見的病理組織型,對(duì)放射治療敏感。常規(guī)放射治療是鼻咽癌最常用和最有效的治療。但是鼻咽癌五年生存率僅為50%左右,而失敗主要原因是鼻咽癌組織對(duì)放射線的抵抗。增加照射劑量,因會(huì)引起周圍組織的損害而受到限制。因此,提高療效只能從增加腫瘤而不增加周圍組織的輻射量,或者提高腫瘤組織相對(duì)于周圍組織的放射敏感性入手。前者涉及改善放療物理因素。后者涉及探索影響腫瘤與正常組織不同放療差別的生物因素。步入分子醫(yī)學(xué)時(shí)代,諸如免疫療法和RNA干擾等靶向目標(biāo)分子治療等走向應(yīng)用。對(duì)于鼻咽癌治療,發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用有潛力的放射敏感相關(guān)生物分子更有意義。受離子輻射的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生自由基,起輻射誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用。而錳型過氧化物酶(SOD2)則能歧化超氧陰離子自由基,降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)放射的敏感性。 研究目的實(shí)驗(yàn)探索錳型過氧化物酶對(duì)鼻咽癌放射抵抗性的影響及其作用機(jī)制。 研究方法①應(yīng)用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2放射前和不同劑量放射后的存活分?jǐn)?shù),應(yīng)用多靶單擊模型和線性二次模型擬合放射存活曲線,測(cè)算放射生物學(xué)參數(shù)D0,Dq,α,β和SF2,比較兩細(xì)胞株的放射敏感性。 ②應(yīng)用水溶四氮唑鹽微孔板實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞株CNE1與CNE2的總SOD和SOD2活性,測(cè)評(píng)SOD活性和SOD2活性與鼻咽癌細(xì)胞株放療敏感或抵抗的關(guān)系。 ③應(yīng)用Western blot檢測(cè)照射前和不同時(shí)間及不同劑量照射后細(xì)胞株CNE1和CNE2的SOD2蛋白表達(dá),測(cè)評(píng)SOD2蛋白表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞株放療敏感或抵抗的關(guān)系和隨輻射劑量時(shí)間的變化。 ⑤使用Gateway(?)-adapted expression vector構(gòu)建表達(dá)miRNA對(duì)SOD2基因RNA干擾的質(zhì)粒。 ⑥采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的針對(duì)SOD2基因的miRNA干擾的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞,cck-8實(shí)驗(yàn)和FCM檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。Western blot和RT-PCR檢測(cè)瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞的SOD2的蛋白和mRNA表達(dá)變化。 ⑦應(yīng)用殺稻瘟素(Blasticidin)篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞,建立針對(duì)SOD2基因表達(dá)miRNA干擾的CNE1細(xì)胞株,檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的SOD2的蛋白和mRNA表達(dá)情況。 ⑧集落形成實(shí)驗(yàn)等測(cè)算和比較穩(wěn)轉(zhuǎn)SOD2基因沉默細(xì)胞的放射生物學(xué)參數(shù),直接測(cè)評(píng)SOD2對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射抵抗的影響。 ⑨x-線2Gy和4Gy輻射接受miRNA沉默SOD2基因治療的CNE1細(xì)胞實(shí)驗(yàn),測(cè)算細(xì)胞生存率,測(cè)評(píng)基因治療對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放射增敏作用。 結(jié)果①鼻咽癌細(xì)胞株放射生物學(xué)參數(shù)在CNE1和CNE2兩細(xì)胞株放射生存曲線上,每一放射劑量點(diǎn)CNE1的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)都高于CNE2。在放射敏感參數(shù)D0、Dq、SF2、α和MID CNE1與CNE2相比的分別為：高出50.97%、高出2.31倍、高出1.67倍、少3.35倍,P0.05。 ②鼻咽癌細(xì)胞CNE1與CNE2的SOD活性和SOD2活性在總SOD活性和SOD2活性水平細(xì)胞株CNE1比CNE2分別高出：63.69%和49.36%,P0.05。 ③鼻咽癌細(xì)胞CNE1與CNE2的SOD2蛋白表達(dá)細(xì)胞株CNE1的SOD2蛋白表達(dá)量是CNE2的量的1.94倍,P0.05。受輻射,CNE1細(xì)胞的SOD2蛋白量增加(P0.05),但是不隨時(shí)間和劑量變化(P0.05); CNE2細(xì)胞的SOD2蛋白量變化不明顯(P0.05)。 ④構(gòu)建靶向SOD2的miRNA載體質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞經(jīng)過質(zhì)粒DNA測(cè)序,質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2(411、424和700)構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1,經(jīng)檢測(cè)EmGFP編碼綠色熒光蛋白,轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞imR-SOD2411、imR-SOD2424、imR-SOD2700與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比,SOD2的mRNA分別下調(diào)37%、52.19%、45.12%,P0.05; SOD2蛋白分別下調(diào)13.43%、51.76%、41.36%,P0.05。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2424抑制細(xì)胞增殖生長25.87%,質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700和陰性質(zhì)粒抑制16.88%和17.15%。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞周期影響不明顯(P0.05)。 ⑤建立沉默SOD2的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1細(xì)胞克隆。穩(wěn)轉(zhuǎn)imR-SOD2700的CNE1細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞相比,SOD2的mRNA分別下調(diào)72.18%,P0.01; SOD2蛋白分別下調(diào)69.95%,P0.05。 ⑥沉默SOD2基因表達(dá)細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)與基因治療實(shí)驗(yàn)在放射生存曲線上,穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1細(xì)胞與無轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞相比每一放射劑量的生存分?jǐn)?shù)減小,在放射生物參數(shù)SF2、D0、α前者比后者分別降低12.81倍、降低2.43、升高2.68倍,P0.05。 ⑦通過沉默SOD2基因-放射增敏治療實(shí)驗(yàn)接受基因治療敲除SOD2基因的CNE1細(xì)胞與未受干擾的CNE1細(xì)胞照射2Gy和4Gy的x-線細(xì)胞的生存率,基因治療的CNE1細(xì)胞比未受治療的CNE1細(xì)胞分別降低2.53倍和3.72倍。 結(jié)論鼻咽癌細(xì)胞株CNE1相比CNE2的放射抵抗性高。SOD和SOD2活性與鼻咽癌細(xì)胞株的放射抵抗有關(guān),活性高的細(xì)胞的放射抵抗性大。SOD2蛋白表達(dá)與鼻咽癌細(xì)胞株的放射抵抗有關(guān),蛋白表達(dá)高的細(xì)胞的放射抵抗性大。構(gòu)建靶向SOD2的質(zhì)粒,能夠表達(dá)miRNA,下調(diào)SOD2基因表達(dá),其中針對(duì)SOD2基因位點(diǎn)700至721的niRNA最有效。miRNA沉默SOD2的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,SOD2基因mRNA和蛋白顯著下調(diào),放射抵抗變?nèi)�。總�?miRNA干擾沉默SOD2基因療法可以應(yīng)用于放療抵抗的鼻咽癌,能使癌癥放療的放射敏感性增高。
【圖文】：

值(0.881士0.132)是CNEZ細(xì)胞D。值(0.266士0.125)的3.31倍。而系數(shù)值小反映細(xì)胞抵抗性大的指標(biāo):CNEZ細(xì)胞的a值(0.763士0.100)是CNEI細(xì)胞a值(0.228士0.070)的3.35倍，兩株細(xì)胞放射參數(shù)比較示意圖見圖2.3。表明CNEI細(xì)胞較CNEZ細(xì)胞的放射抵抗性強(qiáng)。C視l 0101.10存活分效 0246放射荊t(衍) 810圖 2.LCNEI與CNEZ放射生物學(xué)圖(多靶單擊模型)表2.2:CNEI、CNEZ細(xì)胞存活曲線參數(shù)細(xì)胞株CNEICNEZDo(Gy)日(Gy一2)D。(Gy) 0.403士0.(X)5 0.151士0.(X)2 1.398士0.130 0.926士0.068。(Gy一i) 0.228土0.070 0.763士0.100 0.104士0. 0.066士0.037以80.881土0.1320.266士0.125t值P值44.90<0.0001 3.2060 0.0185 4.382() 0.0()47 0.6183 0.5591 3.3710 0.015092.5討論判斷一個(gè)細(xì)胞是否被放射治療殺死，要看它是否喪失無限增殖能力。測(cè)評(píng)細(xì)胞是否喪失無限增殖潛能最常用是克隆或集落形成實(shí)驗(yàn)143]，是因?yàn)榇婊罴?xì)胞具有“集落形成能的“金標(biāo)準(zhǔn)””或144]�！翱寺　蹦芰�。集落形成是放射實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞被輻射后增殖潛由此實(shí)驗(yàn)繪制的生長曲線是最常用于測(cè)定并很好反映人細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)利用高水溶性四氮哇鹽(wST-l)被超氧陰離子還原生成水溶性甲月替過程，呈現(xiàn)黃色至紫色，可用450lun光柵酶標(biāo)儀檢測(cè)。O獷還原WST-1效率與黃嚓吟氧化酶活性有線性關(guān)系，還原過程能被SOD抑制，原理見圖3.1，，因此，能用比色的方法檢測(cè)SOD活性50%的抑制濃度。圖3.1:SOD活性檢瀏的機(jī)理各組450nm光波吸收平均值見表3.1。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2584937