【摘要】： 背景鼻咽癌流行于中國南方。低分化型是鼻咽癌最常見的病理組織型,對放射治療敏感。常規(guī)放射治療是鼻咽癌最常用和最有效的治療。但是鼻咽癌五年生存率僅為50%左右,而失敗主要原因是鼻咽癌組織對放射線的抵抗。增加照射劑量,因會引起周圍組織的損害而受到限制。因此,提高療效只能從增加腫瘤而不增加周圍組織的輻射量,或者提高腫瘤組織相對于周圍組織的放射敏感性入手。前者涉及改善放療物理因素。后者涉及探索影響腫瘤與正常組織不同放療差別的生物因素。步入分子醫(yī)學時代,諸如免疫療法和RNA干擾等靶向目標分子治療等走向應用。對于鼻咽癌治療,發(fā)現和應用有潛力的放射敏感相關生物分子更有意義。受離子輻射的細胞會產生自由基,起輻射誘導細胞毒作用。而錳型過氧化物酶(SOD2)則能歧化超氧陰離子自由基,降低哺乳動物細胞對放射的敏感性。 研究目的實驗探索錳型過氧化物酶對鼻咽癌放射抵抗性的影響及其作用機制。 研究方法①應用集落形成實驗檢測鼻咽癌細胞株CNE1和CNE2放射前和不同劑量放射后的存活分數,應用多靶單擊模型和線性二次模型擬合放射存活曲線,測算放射生物學參數D0,Dq,α,β和SF2,比較兩細胞株的放射敏感性。 ②應用水溶四氮唑鹽微孔板實驗測定細胞株CNE1與CNE2的總SOD和SOD2活性,測評SOD活性和SOD2活性與鼻咽癌細胞株放療敏感或抵抗的關系。 ③應用Western blot檢測照射前和不同時間及不同劑量照射后細胞株CNE1和CNE2的SOD2蛋白表達,測評SOD2蛋白表達與鼻咽癌細胞株放療敏感或抵抗的關系和隨輻射劑量時間的變化。 ⑤使用Gateway(?)-adapted expression vector構建表達miRNA對SOD2基因RNA干擾的質粒。 ⑥采用脂質體轉染法將構建的針對SOD2基因的miRNA干擾的質粒轉染CNE1細胞,cck-8實驗和FCM檢測轉染質粒對細胞增殖和細胞周期的影響。Western blot和RT-PCR檢測瞬轉細胞的SOD2的蛋白和mRNA表達變化。 ⑦應用殺稻瘟素(Blasticidin)篩選轉染細胞,建立針對SOD2基因表達miRNA干擾的CNE1細胞株,檢測穩(wěn)轉細胞的SOD2的蛋白和mRNA表達情況。 ⑧集落形成實驗等測算和比較穩(wěn)轉SOD2基因沉默細胞的放射生物學參數,直接測評SOD2對鼻咽癌細胞放射抵抗的影響。 ⑨x-線2Gy和4Gy輻射接受miRNA沉默SOD2基因治療的CNE1細胞實驗,測算細胞生存率,測評基因治療對鼻咽癌細胞放射增敏作用。 結果①鼻咽癌細胞株放射生物學參數在CNE1和CNE2兩細胞株放射生存曲線上,每一放射劑量點CNE1的細胞存活分數都高于CNE2。在放射敏感參數D0、Dq、SF2、α和MID CNE1與CNE2相比的分別為：高出50.97%、高出2.31倍、高出1.67倍、少3.35倍,P0.05。 ②鼻咽癌細胞CNE1與CNE2的SOD活性和SOD2活性在總SOD活性和SOD2活性水平細胞株CNE1比CNE2分別高出：63.69%和49.36%,P0.05。 ③鼻咽癌細胞CNE1與CNE2的SOD2蛋白表達細胞株CNE1的SOD2蛋白表達量是CNE2的量的1.94倍,P0.05。受輻射,CNE1細胞的SOD2蛋白量增加(P0.05),但是不隨時間和劑量變化(P0.05); CNE2細胞的SOD2蛋白量變化不明顯(P0.05)。 ④構建靶向SOD2的miRNA載體質粒與轉染CNE1細胞經過質粒DNA測序,質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2(411、424和700)構建成功。質粒轉染鼻咽癌細胞CNE1,經檢測EmGFP編碼綠色熒光蛋白,轉染成功。轉染的細胞imR-SOD2411、imR-SOD2424、imR-SOD2700與未轉染的細胞相比,SOD2的mRNA分別下調37%、52.19%、45.12%,P0.05; SOD2蛋白分別下調13.43%、51.76%、41.36%,P0.05。轉染質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2424抑制細胞增殖生長25.87%,質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700和陰性質粒抑制16.88%和17.15%。轉染質粒對細胞周期影響不明顯(P0.05)。 ⑤建立沉默SOD2的穩(wěn)定轉染細胞株經抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉染質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1細胞克隆。穩(wěn)轉imR-SOD2700的CNE1細胞與未轉染的CNE1細胞相比,SOD2的mRNA分別下調72.18%,P0.01; SOD2蛋白分別下調69.95%,P0.05。 ⑥沉默SOD2基因表達細胞放射生物學參數與基因治療實驗在放射生存曲線上,穩(wěn)轉質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1細胞與無轉染的CNE1細胞相比每一放射劑量的生存分數減小,在放射生物參數SF2、D0、α前者比后者分別降低12.81倍、降低2.43、升高2.68倍,P0.05。 ⑦通過沉默SOD2基因-放射增敏治療實驗接受基因治療敲除SOD2基因的CNE1細胞與未受干擾的CNE1細胞照射2Gy和4Gy的x-線細胞的生存率,基因治療的CNE1細胞比未受治療的CNE1細胞分別降低2.53倍和3.72倍。 結論鼻咽癌細胞株CNE1相比CNE2的放射抵抗性高。SOD和SOD2活性與鼻咽癌細胞株的放射抵抗有關,活性高的細胞的放射抵抗性大。SOD2蛋白表達與鼻咽癌細胞株的放射抵抗有關,蛋白表達高的細胞的放射抵抗性大。構建靶向SOD2的質粒,能夠表達miRNA,下調SOD2基因表達,其中針對SOD2基因位點700至721的niRNA最有效。miRNA沉默SOD2的穩(wěn)轉細胞,SOD2基因mRNA和蛋白顯著下調,放射抵抗變弱。總之,miRNA干擾沉默SOD2基因療法可以應用于放療抵抗的鼻咽癌,能使癌癥放療的放射敏感性增高。
【圖文】：

值(0.881士0.132)是CNEZ細胞D。值(0.266士0.125)的3.31倍。而系數值小反映細胞抵抗性大的指標:CNEZ細胞的a值(0.763士0.100)是CNEI細胞a值(0.228士0.070)的3.35倍，兩株細胞放射參數比較示意圖見圖2.3。表明CNEI細胞較CNEZ細胞的放射抵抗性強。C視l 0101.10存活分效 0246放射荊t(衍) 810圖 2.LCNEI與CNEZ放射生物學圖(多靶單擊模型)表2.2:CNEI、CNEZ細胞存活曲線參數細胞株CNEICNEZDo(Gy)日(Gy一2)D。(Gy) 0.403士0.(X)5 0.151士0.(X)2 1.398士0.130 0.926士0.068。(Gy一i) 0.228土0.070 0.763士0.100 0.104士0. 0.066士0.037以80.881土0.1320.266士0.125t值P值44.90<0.0001 3.2060 0.0185 4.382() 0.0()47 0.6183 0.5591 3.3710 0.015092.5討論判斷一個細胞是否被放射治療殺死，要看它是否喪失無限增殖能力。測評細胞是否喪失無限增殖潛能最常用是克隆或集落形成實驗143]，是因為存活細胞具有“集落形成能的“金標準””或144]�！翱寺　蹦芰�。集落形成是放射實驗測定細胞被輻射后增殖潛由此實驗繪制的生長曲線是最常用于測定并很好反映人細胞

實驗利用高水溶性四氮哇鹽(wST-l)被超氧陰離子還原生成水溶性甲月替過程，呈現黃色至紫色，可用450lun光柵酶標儀檢測。O獷還原WST-1效率與黃嚓吟氧化酶活性有線性關系，還原過程能被SOD抑制，原理見圖3.1，，因此，能用比色的方法檢測SOD活性50%的抑制濃度。圖3.1:SOD活性檢瀏的機理各組450nm光波吸收平均值見表3.1。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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本文編號：2584937