【摘要】： 【研究背景與目的】 鼻咽癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在我國(guó)南方地區(qū)尤為高發(fā),由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌細(xì)胞對(duì)射線較為敏感的特點(diǎn),目前放射治療被認(rèn)為是首選的治療手段,一直以來(lái),常規(guī)分割放射治療作為鼻咽癌及其它惡性腫瘤的放射治療方法在臨床上己得到公認(rèn),而且也得到了比較好的臨床治療結(jié)果,但部分患者放療后未控或局部復(fù)發(fā)導(dǎo)致鼻咽癌常規(guī)放療失敗。、已有較多的臨床研究認(rèn)為鼻咽癌常規(guī)分割放射治療失敗的原因?yàn)榉暖熤写嬖谀[瘤細(xì)胞加速再增殖,故研究其機(jī)制,尋找克服放療中腫瘤細(xì)胞加速再增殖途徑是提高腫瘤局部控制率的一大關(guān)鍵。 已有研究證實(shí),細(xì)胞受照射后其增殖活性的改變與細(xì)胞周期基因有關(guān)。為了探索鼻咽癌常規(guī)放療中腫瘤細(xì)胞加速增殖的機(jī)制,本課題組前期已應(yīng)用不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株(CNE2)在連續(xù)分割照射中的細(xì)胞增殖狀態(tài)進(jìn)行研究,明確了CNE2細(xì)胞株在連續(xù)分割照射中確實(shí)存在中后期加速再增殖現(xiàn)象,同時(shí)應(yīng)用基因芯片技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出與照射后CNE2細(xì)胞株增殖狀態(tài)相關(guān)的差異基因：CDC25A、CUL5、p21、DDA3、CCNG1、ABL1、CDKN1A、CKS2、CCNE1、CDC2、CDKN2C、CCND3等,CUL5為細(xì)胞增殖活性增高時(shí)顯著上調(diào)的基因之一,其在照射增殖活性最高時(shí)相與最低時(shí)相表達(dá)差異在2倍以上,因此筆者選擇CUL5作為開(kāi)展功能研究的目的基因。本研究通過(guò)離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法,采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制CUL5基因的表達(dá),探索CUL5基因表達(dá)情況對(duì)鼻咽癌放射治療中細(xì)胞增殖活性的影響。 RNAi是近年來(lái)迅速發(fā)展的基因阻斷技術(shù),其可通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo)特異性降解靶mRNA,從而抑制或阻斷目的基因表達(dá)。該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。目前RNAi方法的應(yīng)用在腫瘤放射治療領(lǐng)域主要集中在放療增敏方面,本研究利用RNAi技術(shù)的特異性、高效性、自身無(wú)細(xì)胞毒性等基本特點(diǎn),直接對(duì)CNE2細(xì)胞株進(jìn)行CUL5基因功能研究,探討出CUL5在連續(xù)分割照射下鼻咽癌細(xì)胞加速再增殖現(xiàn)象中所起的作用,為初步探明鼻咽癌常規(guī)放療中腫瘤細(xì)胞加速增殖的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 【研究方法】 1.構(gòu)建、培養(yǎng)穩(wěn)定抑制CUL5基因表達(dá)的細(xì)胞株：構(gòu)建重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入CNE2中,經(jīng)過(guò)G418毒性實(shí)驗(yàn)及陽(yáng)性克隆有限稀釋法篩選、培養(yǎng)出抑制CUL5表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5。 2.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)在mRNA水平上驗(yàn)證照射前、后所構(gòu)建細(xì)胞株CUL5基因的干擾效果。 3.四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)在60Co-γ線,2Gy/d,連續(xù)5d的照射下細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖變化情況。 【研究結(jié)果】 1.構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定符合要求；經(jīng)轉(zhuǎn)染、篩選、培養(yǎng),培育出CUL5表達(dá)抑制的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及陰性對(duì)照細(xì)胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。 2. RT-PCR檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞CUL5基因的表達(dá)情況,通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析電泳條帶,以β-actin為內(nèi)參校正,測(cè)定空白對(duì)照組(CNE2組)、陰性對(duì)照組(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC組)、實(shí)驗(yàn)組(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5組)CUL5的灰度比,照射前各組分別為0.122、0.175、0.004,實(shí)驗(yàn)組CUL5基因表達(dá)受到明顯抑制；照射第1、3、5天實(shí)驗(yàn)組CUL5基因表達(dá)較對(duì)照組仍受到明顯抑制。 3.MTT法檢測(cè)表明：連續(xù)分割照射5d期間,CNE2組及CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC組細(xì)胞以第3天增殖率最高(分別為122.4%,120.7%),CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5組第1天增殖率最高(103%),3組均以第5天最低。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明：CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5組在連續(xù)分割照射第1天增殖速度最快(SPF值=29.35,PI值=43.32),后逐漸下降,第5天增殖最慢(SPF值=15.47,PI值=25.32)；CNE2組第3天增殖速度最快(SPF值=35.34,PI值=50.69),第5天增殖最慢(SPF值=19.35,PI值=30.67)。兩組比較,CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5組增殖速度減慢且未出現(xiàn)加速增殖現(xiàn)象。 【研究結(jié)論】 1.成功培育出CUL5表達(dá)抑制的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及陰性對(duì)照細(xì)胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。 2. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5細(xì)胞無(wú)論是在照射前(即未照射)還是在照射后,CUL5的表達(dá)均下調(diào),說(shuō)明對(duì)CUL5的干擾作用有效且穩(wěn)定。 3. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5細(xì)胞在連續(xù)分割照射5d期間的生長(zhǎng)增殖速度減慢,且呈逐天下降趨勢(shì),說(shuō)明抑制CUL5表達(dá)后,鼻咽癌照射加速再增殖現(xiàn)象有所改變,這將為尋找鼻咽癌基因治療的靶點(diǎn)、研究靶向治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
【圖文】：

siRNA下調(diào)最明顯，可作為構(gòu)建CULS干擾RNA真核細(xì)胞表達(dá)載體的靶點(diǎn)。in5改LUa壓CPPPD盆DP盆 bbbb.nLUonUnUn“0幾U60孫40勸2010圖1一5Figl一5CULS基因表達(dá)的電泳結(jié)果 ExPressionsofC毛 JLSafterthetransfeetionofsiRNAsM:6OODNAMarker;1:CULS一669;2:CULS一 1190;3:CULS一2039;4:陰性對(duì)照(NC)圖1一6CULS基因與內(nèi)參的灰度比Figl一 6GreysealesofCULSandB一aetin2.2重組質(zhì)粒的鑒定2.2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定酶切結(jié)果表明，所有質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組載體(圖1一7)。(注:空質(zhì)粒上帶有BamHI、Pstl、Bb:工3個(gè)酶切位點(diǎn)。Pstl的位置介于Bb:I和BamHI之間，插入目的基因片段后，Pstl酶切位點(diǎn)被取代，故不能被Pstl所酶切。鑒定時(shí)用BamHI，Pstl分別酶切，Pstl酶切結(jié)果顯示有2條帶，

siRNA下調(diào)最明顯，可作為構(gòu)建CULS干擾RNA真核細(xì)胞表達(dá)載體的靶點(diǎn)。in5改LUa壓CPPPD盆DP盆 bbbb.nLUonUnUn“0幾U60孫40勸2010圖1一5Figl一5CULS基因表達(dá)的電泳結(jié)果 ExPressionsofC毛 JLSafterthetransfeetionofsiRNAsM:6OODNAMarker;1:CULS一669;2:CULS一 1190;3:CULS一2039;4:陰性對(duì)照(NC)圖1一6CULS基因與內(nèi)參的灰度比Figl一 6GreysealesofCULSandB一aetin2.2重組質(zhì)粒的鑒定2.2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定酶切結(jié)果表明，所有質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組載體(圖1一7)。(注:空質(zhì)粒上帶有BamHI、Pstl、Bb:工3個(gè)酶切位點(diǎn)。Pstl的位置介于Bb:I和BamHI之間，，插入目的基因片段后，Pstl酶切位點(diǎn)被取代，故不能被Pstl所酶切。鑒定時(shí)用BamHI，Pstl分別酶切，Pstl酶切結(jié)果顯示有2條帶，
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2585574