【摘要】： 目的研究糖尿病大鼠玻璃體腔移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUMSCs)對(duì)視網(wǎng)膜的影響。 方法本課題分為兩部分：第一部分采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法無(wú)菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,酶消化法獲取hUMSCs,進(jìn)行培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hUMSCs的表面標(biāo)志物。第二部分78只成年健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和正常對(duì)照組兩組,在鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的糖尿病模型建立6W后,左眼玻璃體腔移植PKH-26標(biāo)記的2μl3×104hUMSCs/DMEM-F12設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,右眼玻璃體腔注射等量的DMEM-F12設(shè)為對(duì)照組,根據(jù)處死動(dòng)物的時(shí)間不同分為U1D1、U2D2、U4D4組,于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)深度麻醉處死動(dòng)物,取眼球進(jìn)行觀(guān)察。熒光顯微鏡下觀(guān)察移植細(xì)胞在玻璃體腔中的存活、遷移和整合至宿主視網(wǎng)膜情況。HE染色比較不同處理組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化,且分別對(duì)比不同處理組視網(wǎng)膜內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)和外核層(outer nuclear layer, ONL)的厚度。熒光免疫組化觀(guān)察視網(wǎng)膜組織中GFAP蛋白的表達(dá)。Western-blot和real time-PCR分別檢測(cè)不同處理組中GFAP、NSE、Rhodopsin蛋白和mRNA在視網(wǎng)膜的表達(dá)。 結(jié)果 1.從人臍帶中分離出的間充質(zhì)干細(xì)胞為梭形,呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)；細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD29、CD105(SH2)、CD73(SH3),不表達(dá)CD14、CD34、CD31、CD45、HLA-DR,陽(yáng)性細(xì)胞超過(guò)95%以上,細(xì)胞純度較高。 2.移植玻璃體腔的hUMSCs在玻璃體腔發(fā)生遷移,主要沿內(nèi)界膜分布,僅少部分整合至神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。糖尿病大鼠與正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度比較,差異具有顯著性(P0.05)；U4與D4內(nèi)核層厚度對(duì)比,差異具有顯著性(P0.05)；U1和D1以及U2和D2內(nèi)核層厚度對(duì)比,差異均不具有顯著性意義(P0.05)。外核層厚度的對(duì)比在各組間差異均不具有顯著性意義(P0.05)。 3.糖尿病6W大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)不明顯,神經(jīng)纖維層(nerve fiber layer, NFL)變薄,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)數(shù)目減少,細(xì)胞邊界欠清；INL和ONL細(xì)胞邊界欠清,細(xì)胞核色澤加深,INL細(xì)胞稀疏,密度減少,ONL內(nèi)側(cè)細(xì)胞密集,外側(cè)部分細(xì)胞相對(duì)密度減少；余未見(jiàn)明顯病理改變。 糖尿病大鼠玻璃體腔移植hUMSCs 1W組(U1)和對(duì)照1W組(D1)組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異；U2和D2組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化同1W處理組對(duì)比,RGCs數(shù)量有不同程度減少,D2組較U2組INL與ONL均變��；U4組與D4組對(duì)比RGCs細(xì)胞數(shù)量稀疏,細(xì)胞核深染,D4組較U4組NFL扁平；INL變薄且結(jié)構(gòu)紊亂；ONL排列較亂。 4.免疫熒光染色示糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中GFAP的表達(dá)要高于正常對(duì)照組；在U1和D1組的GFAP表達(dá)對(duì)比,U1組中的表達(dá)量強(qiáng)于D1；U2和D2組中對(duì)比GFAP的表達(dá),D2組中的表達(dá)量強(qiáng)于U2；U4和D4組中對(duì)比GFAP的表達(dá),D4組中的GFAP表達(dá)要強(qiáng)。 5.糖尿病6W組視網(wǎng)膜GFAP、NSE以及Rhodopsin mRNA的表達(dá),與正常對(duì)照組相比差異有顯著性(P0.05)；U1與D1組對(duì)比,視網(wǎng)膜GFAP、NSE以及Rhodopsin mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05); GFAP和Rhodopsin mRNA的表達(dá)在U2與D2以及U4與D4組間對(duì)比,差異有顯著性(P0.05),U4與D4組對(duì)比NSE表達(dá)與對(duì)照組差異有顯著性(P0.05)。視網(wǎng)膜GFAP蛋白在正常組中為低表達(dá),隨糖尿病的進(jìn)展而表達(dá)增加；NSE和Rhodopsin則相反；玻璃體腔移植早期對(duì)比同期對(duì)照,蛋白表達(dá)差異不明顯；4W可見(jiàn)明顯差異。 結(jié)論1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠,是模擬人非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的一種可靠的動(dòng)物模型。 2. hUMSCs移植到糖尿病大鼠玻璃體腔后能夠存活、遷移并整合到受損的視網(wǎng)膜上 3.糖尿病大鼠玻璃體腔移植hUMSCs,推斷其可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜出現(xiàn)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),這可能對(duì)視網(wǎng)膜的損傷起到保護(hù)作用。
【圖文】：

少量為多突起的星形樣細(xì)胞。細(xì)胞折光度好，核仁明顯，胞體較BMSCs稍寬大。每個(gè)細(xì)胞集落細(xì)胞數(shù)達(dá)到上百個(gè)或數(shù)百個(gè)。細(xì)胞形態(tài)漸變?yōu)榫坏募忓N形(圖2)。成纖維樣細(xì)胞增殖能力旺盛，至Zw左右可達(dá)到80%融合，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)則受到明顯抑制。用0.25%胰酶消化，傳代后可得到純化的成纖維樣細(xì)胞。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定(圖3)。圖2原代達(dá)到融合的貼壁細(xì)胞，，星漩渦狀排列Zoox圖3第二代貼壁細(xì)胞ZooX 1.2.2免疫表型的鑒定對(duì)第3代UCMSCs行流式細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)。表明hUMSCs強(qiáng)烈表達(dá)CD29、CD105(SHZ)、CD73(SH3)，不表達(dá)CD14、CD34、CD31、CD45、HLA一DR(圖3)。CD29屬于整合素家族， CD105(SHZ)、Cn73(SH3)是間充質(zhì)相關(guān)抗原

1.3討論1.3.1間充質(zhì)干細(xì)胞的概述IbJ充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymalstemeells，MSCs)通常是指來(lái)源于中髓或其他組織中分離到的成體干細(xì)胞，在體外具有多向分化潛能，中胚層組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌)Jw、脂肪及基質(zhì)細(xì)胞等增殖可在適宜條件下向內(nèi)胚層的肝卵圓性細(xì)胞、外胚層的神經(jīng)細(xì)胞等非分化【’，2]，是造血微環(huán)境中的一種重要細(xì)胞成分，而且免疫原性弱，質(zhì)干細(xì)胞不僅能夠向多種組織和細(xì)胞分化，而且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的過(guò)程中始終保持多向分遺傳背景相當(dāng)穩(wěn)定。是組織工程理想的種子細(xì)胞來(lái)源I3.“}。目前認(rèn)為干細(xì)胞進(jìn)入微環(huán)境后對(duì)分化信號(hào)的反應(yīng)受周?chē)谶M(jìn)行胞影響，并對(duì)新的微環(huán)境中的調(diào)節(jié)信號(hào)做出反應(yīng)，可稱(chēng)之為“環(huán)境誘細(xì)胞對(duì)環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)能力隨時(shí)間而變化，反應(yīng)強(qiáng)弱取決于細(xì)胞表
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R774.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2580167