【摘要】：角膜是位于眼睛最前方的透明組織，是行使眼屈光功能的重要組成部分。當(dāng)角膜受到來自微生物、機(jī)械力、化學(xué)物和熱力等作用造成損傷時(shí)，易引發(fā)各種角膜疾病，造成角膜混濁，輕者影響視力，重者甚至致盲。角膜的深度燙傷、化學(xué)灼傷及機(jī)械劃傷不僅會(huì)導(dǎo)致上皮層的功能缺失，還會(huì)造成深度的基質(zhì)創(chuàng)傷，需要進(jìn)行移植以替代受損的上皮-基質(zhì)部分。行穿透性角膜移植對(duì)角膜創(chuàng)傷較大，術(shù)后引發(fā)免疫排斥和新生血管的風(fēng)險(xiǎn)比板層移植要高，且角膜內(nèi)皮層并沒有損傷，行板層移植可以保留原內(nèi)皮層和部分基質(zhì)，但需要分別進(jìn)行兩次移植手術(shù)以分別替換受損基質(zhì)和上皮，可是多次創(chuàng)傷修復(fù)也容易導(dǎo)致新生血管，影響手術(shù)預(yù)期的效果。如果能運(yùn)用組織工程技術(shù)重建出組織工程半角膜（角膜上皮-基質(zhì)復(fù)合物）（Tissue-engineered human hemicornea, TE-hHC），將會(huì)減少二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，提高手術(shù)移植的效果。另外由于供體材料的缺乏，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足角膜移植手術(shù)的需要，亟需找到一種合適的材料以代替天然角膜，組織工程半角膜將會(huì)是合適的半角膜替代物，對(duì)滿足角膜前板層移植的需求具有重要意義。 種子細(xì)胞和載體支架是體外重建TE-hHC的兩大要素。目前用于組織工程的種子細(xì)胞可來源于原代細(xì)胞、干細(xì)胞及轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，用作載體支架的材料包括天然高分子材料和合成高分子材料。但原代細(xì)胞數(shù)量少，干細(xì)胞的成功誘導(dǎo)還需進(jìn)一步證實(shí)，轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞存在安全問題，膠原等自然高分子材料降解快、機(jī)械強(qiáng)度低，而合成高分子材料生物相容性差。本文采用的非轉(zhuǎn)染、無(wú)致瘤性的HCEP（human corneal epithelium, HCEP）細(xì)胞和基質(zhì)（human corneal stroma, HCS）細(xì)胞，具有細(xì)胞種屬和功能正常，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂旺盛，安全性高等優(yōu)點(diǎn)，作為重建TE-hHC的種子細(xì)胞來源。本文利用實(shí)驗(yàn)室業(yè)已建立的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)（acellular porcine corneal stroma, aPCS）制備技術(shù)工藝，制備出透明性好，與細(xì)胞有較好生物相容性的aPCS，作為體外重建TE-hHC的載體支架。 為了檢驗(yàn)HCEP細(xì)胞和HCS細(xì)胞是否適合作為TE-hHC的種子細(xì)胞，本文鑒定了這兩種細(xì)胞的特征。鑒定結(jié)果顯示：第90代HCEP細(xì)胞和第25代HCS細(xì)胞分別呈典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)和成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)與分裂旺盛，群體倍增時(shí)間分別為39.2小時(shí)和43.3小時(shí)，特征性染色體數(shù)目都仍為46，核型都為（5M+12SM+5ST+Y），二者的G帶帶型也均正常，且裸鼠接種實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者均沒有致瘤性，前者具有HCEP細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白——角蛋白3、角蛋白12以及細(xì)胞連接蛋白ZO-1、E-鈣粘蛋白、間隙連接蛋白-43、整聯(lián)蛋白β1的陽(yáng)性表達(dá)，后者具有HCS細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白——波形蛋白以及細(xì)胞連接蛋白——整聯(lián)蛋白β1和間隙連接蛋白-43、功能蛋白——乙醛脫氫酶3A1、鈉鉀泵和鈣泵的陽(yáng)性表達(dá)。表明第90代HCEP細(xì)胞和第25代HCS細(xì)胞的屬性和功能蛋白表達(dá)正常，適于用作TE-hHC體外重建的種子細(xì)胞。 本文利用本實(shí)驗(yàn)室業(yè)已建立的aPCS制備技術(shù)工藝，成功制備出了透明度高、機(jī)械性能好、可降解且生物相容性好的aPCS，并選用帶有前彈力層的aPCS作為載體支架、選用屬性和功能蛋白表達(dá)正常的第90代HCEP細(xì)胞以及第25代HCS細(xì)胞為種子細(xì)胞，進(jìn)行了TE-hHC的體外重建研究。首先，采用微量注射的方法將HCS細(xì)胞注入aPCS支架材料中，在含10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液、37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí)；其次，將HCEP細(xì)胞接種于aPCS的前彈力層面，換用10%胎牛血清的DMEM/F12（3:1）培養(yǎng)液采用氣-液界面培養(yǎng)方法持續(xù)培養(yǎng)6天，獲得TE-hHC；最后，并利用光鏡觀察、石蠟切片HE染色、茜素紅染色、免疫組織熒光、掃描電鏡和透射電鏡等方法對(duì)重建所得TE-hHC的形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能蛋白表達(dá)等進(jìn)行了鑒定。TE-hHC的體外重建及其鑒定結(jié)果顯示，TE-hHC透明度較高，aPCS支架內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞伸展良好，與支架材料結(jié)合緊密；aPCS支架表面形成6~7層的復(fù)層上皮結(jié)構(gòu)，表層細(xì)胞連接緊密，表面有豐富的微絨毛結(jié)構(gòu)，整個(gè)上皮層細(xì)胞之間以及細(xì)胞與aPCS之間均形成了細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，與正常半角膜的結(jié)構(gòu)相近；TE-hHC的HCEP細(xì)胞和HCS細(xì)胞的特征性蛋白、功能蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性，與正常細(xì)胞的表型和功能相同。上述結(jié)果顯示，本文以帶有前彈力層的aPCS為載體支架、以第90代HCEP細(xì)胞以及第25代HCS細(xì)胞為種子細(xì)胞體外重建的TE-hHC，具有與活體角膜相似的組織結(jié)構(gòu)，其種子細(xì)胞并具有功能蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，表明其可能具有半角膜的生物學(xué)功能。 為了鑒定體外重建TE-hHC的生物學(xué)功能，，本文選用比格犬和獼猴進(jìn)行了TE-hHC的前板層移植實(shí)驗(yàn)，并通過過裂隙燈顯微鏡觀察、角膜測(cè)厚測(cè)壓等方法來評(píng)估在體TE-hHC的透明度、厚度和新生血管等特征。比格犬移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在術(shù)后前期，植片水腫和炎癥反應(yīng)比較嚴(yán)重，角鞏邊際處形成新生血管叢，縫線處新生血管聚集，角膜表面粗糙，角膜不夠透明；但隨著時(shí)間推移，角膜水腫、炎癥及新生血管漸漸消失，角膜透明度逐漸增加；第40天后，整個(gè)角膜已呈透明狀態(tài)。獼猴移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在術(shù)后前期，植片由一開始的水腫模糊狀態(tài)，逐漸消腫澄清，到第30天與對(duì)照眼相比幾乎完全透明；第40天后，植片依舊保持透明，愈合良好。上述動(dòng)物角膜移植結(jié)果表明，本文體外重建所得TE-hHC在動(dòng)物角膜中能發(fā)揮出良好的生物學(xué)功能，可作為捐獻(xiàn)角膜的替代物用于前板層角膜移植，為角膜前板層深度損傷患者利用TE-hHC移植重見光明創(chuàng)造了條件。 綜上所述，本文以細(xì)胞屬性和正常功能的第90代HCEP細(xì)胞和第25代HCS細(xì)胞為種子細(xì)胞，以與這兩種種子細(xì)胞具有良好生物相容性的aPCS為載體支架，成功體外重建了形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能屬性與活體半角膜相似的TE-hHC，比格犬和獼猴前板層角膜移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能發(fā)揮良好的生物學(xué)功能，有望作為捐獻(xiàn)角膜的等效替代物用于半角膜損傷患者的臨床治療、使患者重見光明成為可能。
【圖文】：

細(xì)胞光滑透明，生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖2.1B）；繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)胞在貼壁后 36 小時(shí)基本處于遲緩期，細(xì)胞增殖偏慢，第 36~72 小時(shí)細(xì)胞增殖迅速，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 第 72~96 小時(shí)處于平穩(wěn)期，第 96 小時(shí)以后處于衰亡期，細(xì)胞數(shù)量明顯下降（圖 2.2）；根據(jù)公式計(jì)算得到的細(xì)胞群體倍增時(shí)間是 39.2 小時(shí)，表明細(xì)胞分裂旺盛，狀態(tài)良好。復(fù)蘇的 HCS 細(xì)胞呈典型成纖維樣形態(tài)，細(xì)胞飽滿，成流線型有序排布（圖2.1A）；繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示

體特征 2n=46，5M+12SM+5ST+Y（圖 2.6；圖 2.7A）；G 帶顯示細(xì)胞具有典型的人染色體特征（圖 2.7B）。02040608010012014016018020044 45 46 48 50 52 54 56 58染色體數(shù)胞數(shù)細(xì)圖 2.4 第 90 代 HCEP 細(xì)胞的染色體數(shù)目分布
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R779.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 薛霜;獨(dú)軍政;趙建勇;高閃電;常惠蕓;;整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年01期

本文編號(hào)：2564056