【摘要】：應(yīng)用抑制性消減雜交和差異篩選法,并結(jié)合生物信息學(xué)的分析,克隆到鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào)的新基因LBH。前期轉(zhuǎn)基因研究證實(shí)LBH基因表達(dá)能抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖,初步確定其功能與抑制細(xì)胞周期進(jìn)展有關(guān)。為進(jìn)一步明確LBH基因的作用及機(jī)制,本課題以正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69為模型,采用基因沉默技術(shù)探討LBH基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響及相應(yīng)的分子機(jī)制。 目的: 以LBH基因正常表達(dá)的人鼻咽上皮細(xì)胞NP69為模型,通過(guò)基因沉默技術(shù)使LBH表達(dá)下調(diào),闡明LBH基因沉默調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制。 方法: 1.設(shè)計(jì)、合成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小分子干擾RNA(siRNA),轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞,使LBH基因沉默,采用Real-Time quantitative PCR技術(shù)檢測(cè)不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染后LBH基因表達(dá),優(yōu)化獲得LBH基因沉默最佳效果的條件; 2.利用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測(cè)LBH基因沉默對(duì)NP69細(xì)胞周期的影響; 3.通過(guò)Real-Time quantitative PCR、Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá),初步確定LBH基因沉默對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制; 4.進(jìn)一步采用雙報(bào)道系統(tǒng)探討LBH基因沉默對(duì)NF-κB和Cyclin D1轉(zhuǎn)錄活性的影響,從而研究細(xì)胞周期相關(guān)基因調(diào)控機(jī)理。 結(jié)果: 1.通過(guò)對(duì)LBH基因表達(dá)水平的檢測(cè),相對(duì)對(duì)照組,30nM siRNA轉(zhuǎn)染NP69細(xì)胞48h后即可獲得最好的LBH基因沉默效果,沉默效率達(dá)到91%; 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組中G1期和S期的細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的49.94%和49.75%,LBH基因沉默組中G1期和S期細(xì)胞的比例分別為44.40%和54.17%,表現(xiàn)為G1減少及S期增加的特點(diǎn); 3. NP69細(xì)胞中Cyclin E2基因在LBH-siRNA轉(zhuǎn)染48h后,其相對(duì)表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組上調(diào)95%,Cyclin E1基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化; 4. Western檢測(cè)結(jié)果顯示:LBH-siRNA轉(zhuǎn)染組中c-Myc、Cyclin E2、p-Rb、Rb蛋白表達(dá)上調(diào),而Cdc25A蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別; 5.熒光素酶測(cè)定表明:LBH-siRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后,NF-κB轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)上調(diào)358%和230%,Cyclin D1轉(zhuǎn)錄活性相應(yīng)上調(diào)407%和349%。 結(jié)論: 1.靶向于LBH基因的LBH-siRNA能有效沉默NP69細(xì)胞中LBH基因的表達(dá); LBH基因沉默通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期G1-S期R點(diǎn)的一個(gè)關(guān)鍵的周期蛋白Cyclin E2表達(dá)促進(jìn)了NP69細(xì)胞G1-S期的進(jìn)展。LBH基因沉默后,c-Myc、P-Rb、Rb蛋白表達(dá)上調(diào),而Cdc25A蛋白表達(dá)無(wú)變化,由此推測(cè)LBH基因沉默通過(guò)C-Myc上調(diào)Cyclin E2的表達(dá),進(jìn)而激活下游效應(yīng)分子P-Rb、Rb,最終促進(jìn)NP69細(xì)胞周期G1-S期進(jìn)展,Cdc25A可能沒(méi)有參與c-Myc對(duì)Cyclin E2的調(diào)控。 2. LBH基因沉默通過(guò)上調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,從而上調(diào)C-Myc,Cyclin D1最終促進(jìn)G1-S期細(xì)胞周期的進(jìn)展。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2564067