【摘要】：進(jìn)展期喉癌或者下咽癌的患者常需實(shí)施全喉切除術(shù)，導(dǎo)致患者言語(yǔ)功能和吞咽功能受損。全喉切術(shù)后患者由于無(wú)法與人正常交流，常產(chǎn)生自卑，抑郁，焦慮的情緒，45%的全喉切除術(shù)后患者具有抑郁癥狀，遠(yuǎn)高于其他癌癥患者。隨著頭頸外科手術(shù)技術(shù)的提高，放化療的應(yīng)用，喉癌的5年生存率逐年提高，喉癌的治療重點(diǎn)應(yīng)從單純的追求提高患者生存率向提高患者的生存質(zhì)量轉(zhuǎn)變，要同時(shí)注重恢復(fù)和重建患者的全喉功能，提高患者的社會(huì)參與性和生活質(zhì)量。全喉功能的重建成為喉癌術(shù)后患者和嚴(yán)重喉?yè)p傷患者最熱切的臨床治療需要。 喉是由軟骨，肌肉，黏膜，腺體組成的復(fù)合器官，目前傳統(tǒng)的手術(shù)治療方法無(wú)法完成全喉組織的重建。喉移植是目前對(duì)于全喉切除術(shù)后患者和嚴(yán)重喉?yè)p傷患者唯一有效的重建方法。全世界第一例全喉移植手術(shù)于1998年成功實(shí)施，移植喉可以為患者提供近似正常的發(fā)音，吞咽和呼吸功能。據(jù)報(bào)道有75%的喉癌切除術(shù)后患者愿意接受喉移植手術(shù)。然而第一例喉移植患者系嚴(yán)重喉?yè)p傷患者，為了避免免疫排斥，在移植術(shù)后的12年中長(zhǎng)期服用免疫抑制劑。免疫抑制劑的應(yīng)用常會(huì)導(dǎo)致感染，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，大大限制了喉移植在喉癌術(shù)后患者身上的使用。 由于喉解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，目前沒(méi)有任何一種天然的或者人工合成的材料能夠模擬人喉的結(jié)構(gòu)。組織工程學(xué)的研究為器官重建提供了新的思路，去細(xì)胞同種異體或者異種心臟，肺臟，肝臟支架的構(gòu)建為組織工程器官提供新的支架結(jié)構(gòu)。去細(xì)胞方法可構(gòu)建出具有天然三維結(jié)構(gòu)的支架，該支架復(fù)合種子細(xì)胞可構(gòu)建出具有一定功能的組織或者器官。浸泡法構(gòu)建的去細(xì)胞人喉支架已有報(bào)道，該種方法構(gòu)建的組織工程氣管已有移植報(bào)道，但是運(yùn)用該種去細(xì)胞方法構(gòu)建的支架會(huì)提高支架的順應(yīng)性，導(dǎo)致喉或氣管支架軟化，甚至導(dǎo)致移植術(shù)后喉氣管狹窄。 喉的支撐結(jié)構(gòu)主要在于喉軟骨基質(zhì)成份。喉軟骨細(xì)胞具有合成和分泌軟骨基質(zhì)和膠原纖維的能力，因此喉軟骨細(xì)胞的活性對(duì)于維持喉支架的三維框架結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。軟骨是沒(méi)有血管，沒(méi)有神經(jīng)的組織。軟骨細(xì)胞主要通過(guò)基質(zhì)的滲透作用吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。軟骨細(xì)胞被軟骨基質(zhì)嚴(yán)密包裹這樣就避免了軟骨細(xì)胞與外界的抗原物質(zhì)相接觸。因此通過(guò)血管灌注能夠去除喉組織中高免疫原性的組織而較好的保留軟骨細(xì)胞的活性。 直接的同種異體移植如果不使用免疫抑制劑會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。主要組織相容性抗原（MHC）的表達(dá)是導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)的主要原因。在對(duì)人喉主要組織相容性抗原的研究發(fā)現(xiàn)人喉主要組織相容性抗原分布于黏膜上皮層，黏膜下腺和軟骨膜，軟骨基質(zhì)中不表達(dá)主要組織相容性抗原，軟骨組織在同種異體移植中不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。 本研究通過(guò)靶控麻醉泵向離體喉的頸外動(dòng)脈中持續(xù)灌注去離子劑構(gòu)建保留喉軟骨活性的全喉支架。支架大體觀察，組織學(xué)觀察，顯微結(jié)構(gòu)觀察，DNA含量分析，軟骨細(xì)胞活性檢測(cè)，支架免疫原性檢測(cè)研究通過(guò)灌注法制備出結(jié)構(gòu)完整，無(wú)免疫原性的全喉軟骨三維支架的可行性；將去細(xì)胞全喉軟骨支架埋植到受體大網(wǎng)膜內(nèi)檢測(cè)受體對(duì)支架的大體反應(yīng)情況和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況，研究去細(xì)胞全喉軟骨支架的生物相容性和免疫原性。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植到去細(xì)胞全喉軟骨支架上，觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況，證明支架的毒性和細(xì)胞相容性，細(xì)胞標(biāo)記物示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況，為構(gòu)建組織工程全喉提供理論依據(jù)。 第一部分保留軟骨的去細(xì)胞全喉支架的體外研究 目的：通過(guò)靶控麻醉泵灌注去細(xì)胞液構(gòu)建保留軟骨的去細(xì)胞全喉支架，對(duì)支架進(jìn)行體外研究，探索制備組織工程喉支架的可行性。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠，體重200g左右，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分離頸總動(dòng)脈，結(jié)扎分支，經(jīng)頸總動(dòng)脈通過(guò)靶控麻醉泵向甲狀腺上動(dòng)脈和甲狀腺下動(dòng)脈內(nèi)持續(xù)灌注肝素生理鹽水，1%SDS，1%Triton X-100，PBS等溶液；對(duì)照組，將喉組織從體內(nèi)取出喉，不做任何處理，置于含青鏈霉素的PBS液中與實(shí)驗(yàn)組灌注等長(zhǎng)的時(shí)間。所得標(biāo)本行大體觀察，組織學(xué)觀察，掃描電鏡觀察，DNA含量分子檢測(cè)，軟骨活力檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：全喉的去細(xì)胞灌注實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)14h去細(xì)胞灌注處理后，全喉大體結(jié)構(gòu)完整，喉組織顏色蒼白透明，體積無(wú)明顯變化，硬度無(wú)明顯改變，喉的三維結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。全喉支架去細(xì)胞后除軟骨組織中的細(xì)胞外，其他組織如肌肉，黏膜，腺體等軟組織中的細(xì)胞成份基本上被去除，去細(xì)胞徹底，效果明顯。細(xì)胞外的基質(zhì)成份被完整保留，組織結(jié)構(gòu)清楚，層次分明。組織中的細(xì)胞成份基本上被去除，但全喉細(xì)胞外基質(zhì)成份之間的網(wǎng)狀連接依然存在，膠原束和細(xì)胞外基質(zhì)成份組成的不規(guī)則腔隙存在于喉的會(huì)厭，聲帶，環(huán)狀軟骨，甲狀軟骨等表面。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不含軟骨成份的去細(xì)胞支架中幾乎無(wú)GAPDH基因的擴(kuò)增，而含軟骨成份的去細(xì)胞軟骨支架GAPDH基因的擴(kuò)增遠(yuǎn)低于正常喉組織GAPDH基因的擴(kuò)增。去細(xì)胞后甲狀軟骨，環(huán)狀軟骨中活的細(xì)胞并未見(jiàn)明顯變化，組織絕大多數(shù)細(xì)胞處于成活狀態(tài)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。去細(xì)胞全喉基質(zhì)成份MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ染色陰性。 結(jié)論：通過(guò)靶控麻醉泵持續(xù)給喉的雙側(cè)頸總動(dòng)脈泵入去污劑，可以在較好的保留軟骨細(xì)胞活性的同時(shí)去除喉肌肉，黏膜，腺體等組織中的細(xì)胞，構(gòu)建出完整的全喉軟骨框架結(jié)構(gòu)，該支架的具有良好三維框架結(jié)構(gòu)，較低的免疫原性和較好的機(jī)械力學(xué)結(jié)構(gòu)，可作為全喉缺損修復(fù)的理想支架材料。 第二部分保留軟骨的去細(xì)胞全喉支架的體內(nèi)研究 目的：將去細(xì)胞全喉軟骨支架植入同種異體受體動(dòng)物腹腔內(nèi)，觀察受體對(duì)支架的反應(yīng)，探討支架的免疫原性和生物相容性。 方法：實(shí)驗(yàn)組將供體BN大鼠的離體喉按照實(shí)驗(yàn)一的制備方法經(jīng)頸總動(dòng)脈灌注后構(gòu)建成去細(xì)胞全喉軟骨支架，將支架埋植到受體SD大鼠的大網(wǎng)膜內(nèi)；對(duì)照組將供體BN大鼠的離體喉不做任何處理直接埋植到受體SD大鼠的大網(wǎng)膜內(nèi)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于埋植后2周，4周，8周，12周后取出埋植的標(biāo)本行大體觀察，HE染色觀察，CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫組化觀察。 結(jié)果：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各組動(dòng)物均存活至各觀察時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)物一般狀況良好，傷口愈合良好，，無(wú)明顯的傷口裂開(kāi)，滲血，溢膿等情況。所有的對(duì)照組均引起了強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，對(duì)照組喉被大網(wǎng)膜形成的纖維組織嚴(yán)密包裹，持續(xù)的炎性刺激使得纖維膜變得很厚。對(duì)照組可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞增生，黏膜，腺體，肌肉，軟骨組織受到了不同程度度破壞。CD8+T細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞在各觀察點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量在正常喉埋植后明顯高于去細(xì)胞全喉軟骨支架埋植體內(nèi)后。去細(xì)胞喉支架埋植體內(nèi)后并未引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。至各觀察點(diǎn)取出包埋的喉支架發(fā)現(xiàn)，去細(xì)胞喉支架僅被薄層的大網(wǎng)膜包裹，未見(jiàn)明顯的急性或慢性炎性反應(yīng)。去細(xì)胞喉支架埋植體內(nèi)4周后可見(jiàn)新生血管形成和成纖維樣細(xì)胞增生。 結(jié)論：灌注法構(gòu)建的去細(xì)胞全喉軟骨支架埋植于同種異體大鼠的腹腔中，未引起強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)又有新生血管和成纖維樣細(xì)胞的生成說(shuō)明去細(xì)胞全喉軟骨支架具有較好的生物相容性，能促進(jìn)組織和器官的再生。 第三部分去細(xì)胞全喉軟骨支架的再細(xì)胞化研究 目的：研究體外培養(yǎng)擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到去細(xì)胞支架表面，觀察細(xì)胞在支架表面的生長(zhǎng)情況，探討去細(xì)胞全喉軟骨支架再細(xì)胞化的可行性。 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定后，用去細(xì)胞全喉軟骨支架的浸提液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，了解支架的毒性。用CM-Dil標(biāo)記的骨髓干細(xì)胞后以1×106的密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到支架的環(huán)甲肌，環(huán)勺后肌，聲帶等脫細(xì)胞基質(zhì)中，完全培養(yǎng)基，37℃，5%二氧化碳中培養(yǎng)3天，5天，7天后生物顯微鏡，熒光顯微鏡，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果：培養(yǎng)3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞增殖速度快，傳代的細(xì)胞形態(tài)較均一，大多數(shù)呈梭形，漩渦生長(zhǎng)，保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示CD29，CD44表達(dá)陽(yáng)性，且陽(yáng)性率大于90%，此結(jié)果符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞可在支架的浸提液中正常生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)DM-DIl標(biāo)記后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)記率幾乎可達(dá)到100%，將標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到支架上，可見(jiàn)細(xì)胞分散在支架表面，但細(xì)胞分布成團(tuán)狀或者點(diǎn)狀。去細(xì)胞全喉軟骨支架種植骨髓干細(xì)胞后，組織學(xué)可見(jiàn)細(xì)胞主要生長(zhǎng)于喉支架的內(nèi)側(cè)和外側(cè)表面，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分布均勻。掃描電鏡結(jié)果顯示，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到支架上3天可見(jiàn)少量細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)，相互之間伸出胞突，5天后可見(jiàn)細(xì)胞成片狀分布在支架表面，7天后，支架表面形成了一層膜狀結(jié)構(gòu)，鋪滿整個(gè)支架。 結(jié)論：通過(guò)密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)，可獲得純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植到去細(xì)胞全喉軟骨支架上可見(jiàn)細(xì)胞在支架上正常生長(zhǎng)和增殖，提示支架是無(wú)毒的不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡或者突變，支架材料與細(xì)胞支架具有良好的親和性，去細(xì)胞支架具有較好的生物相容性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可作為組織工程喉的種子細(xì)胞。
【圖文】：

全喉大體結(jié)構(gòu)完整，喉組織顏色蒼白透明，體積無(wú)明顯變化，硬度無(wú)明顯改變，喉的三維結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變（圖1.A）。對(duì)照組喉支架顏色鮮紅，結(jié)構(gòu)完整，肌肉、黏膜、軟骨等組織結(jié)構(gòu)完整（圖1.B）。3.1.2 組織學(xué)觀察全喉支架去細(xì)胞后除軟骨組織中的細(xì)胞外，其他組織如肌肉，黏膜，腺體等軟組織中的細(xì)胞成份基本上被去除，去細(xì)胞徹底，效果明顯。細(xì)胞外的基質(zhì)成份被完整保留，組織結(jié)構(gòu)清楚，層次分明（圖 1.C）。正常組織中，肌肉，黏膜，腺體，軟骨中的細(xì)胞和組織保留完整（圖 1.D）。Masson 染色顯示去細(xì)胞全喉支架中細(xì)胞成份被去除，而細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成份被保留下來(lái)（圖 1.E）。正常喉組織中肌肉組織完整紅染，肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，可見(jiàn)軟組織中的膠原成份藍(lán)染（圖 1.F）。熒光顯微鏡顯示去細(xì)胞支架中除軟骨組織外，其它組織中細(xì)胞成份幾乎被去除（圖 G），對(duì)照組中細(xì)胞均勻分散于各種組織中（圖 H）。3.1.3 掃描電鏡觀察去細(xì)胞喉支架的掃描電鏡結(jié)果顯示

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文3.1.4 DNA 含量檢測(cè)去細(xì)胞灌注后，不含軟骨的去細(xì)胞支架中 DNA 平均含量?jī)H為正常喉組織的0.92%。去細(xì)胞組織中 DNA 平均含量為 4.56ng/mg,正常組織中 DNA 平均含量為492.96ng/mg。含軟骨的去細(xì)胞軟骨組織中平均 DNA 含量為 82.56ng/mg。PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不含軟骨成份的去細(xì)胞支架中幾乎無(wú) GAPDH 基因的擴(kuò)增，而含軟骨成份的去細(xì)胞軟骨支架 GAPDH 基因的擴(kuò)增遠(yuǎn)低于正常喉組織 GAPDH 基因的擴(kuò)增（P＜0.05；圖 2）
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 李秋果;;組織工程支架材料研究進(jìn)展及發(fā)展前景[J];長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2012年02期

2 馬瑞娜;崔鵬程;;喉移植免疫學(xué)研究進(jìn)展[J];聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志;2010年03期

3 侯楠;崔鵬程;羅家勝;鄭德育;;灌注法與浸泡法構(gòu)建去細(xì)胞全喉支架的對(duì)比研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2009年05期

本文編號(hào)：2536885