【摘要】：隨著世界人口的增長，青光眼患者數(shù)量也在逐漸增多。青光眼作為全球第二大致盲性眼病，它的治療受到越來越多的人關(guān)注。青光眼是一組以視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡及視神經(jīng)軸索變性丟失，，具體表現(xiàn)為視盤凹陷性萎縮及視野缺損的疾病，且損傷不可逆轉(zhuǎn)。因此，青光眼早期治療上，抵御任何引起視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷和視神經(jīng)軸索變性的因素，是我們目前最需要解決的問題。一直以來，青光眼的治療手段主要依靠降低眼內(nèi)壓，通過降低眼內(nèi)壓力，從而減少壓力對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡。目前對(duì)青光眼的認(rèn)識(shí)已不再停留于單純眼部疾病，更多的討論青光眼是一種神經(jīng)退行性疾病。它與多種神經(jīng)退行性疾病有著相似的病理過程，這為我們進(jìn)一步研究青光眼的治療，提供了新的思路。糖原合酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）是目前研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的激酶，直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)病理過程的發(fā)生發(fā)展，如阿爾茨海默氏病中使Tau蛋白過度磷酸化致神經(jīng)纖維纏結(jié)，使Aβ增多致老年斑形成等等，且臨床上已有抑制其活性的藥物用于治療神經(jīng)退行性疾病。 本研究分別從體外體內(nèi)兩個(gè)方面模擬青光眼高眼壓環(huán)境建立高眼壓模型，即加壓培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞建立體外高眼壓模型和鼠眼全周鞏膜上靜脈結(jié)扎燒灼聯(lián)合全周角鞏緣毛細(xì)血管灼燒術(shù)法誘導(dǎo)大鼠慢性高眼壓模型。通過對(duì)體內(nèi)體外正常對(duì)照，高眼壓模型及GSK3β抑制劑氯化鋰作用后的模型進(jìn)行免疫熒光、Western blot等方法檢測GSK3β的表達(dá)，體外光鏡下對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，MTT檢測吸光度反映細(xì)胞活性，體內(nèi)熒光顯微鏡下對(duì)神經(jīng)元計(jì)數(shù)等，研究GSK3β在高眼壓模型中對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用。本研究共有兩部分。 第一部分糖原合酶激酶3β對(duì)體外加壓培養(yǎng)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞作用的研究 【目的】研究體外加壓培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）中GSK3β活性變化及其對(duì)RGCs細(xì)胞存活的影響。 【方法】混合培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs），分為RGCs對(duì)照組，單純RGCs加壓組（60mmHg壓力下培養(yǎng)24h），RGCs中加壓+10mmol/L氯化鋰（Licl，GSK3β抑制劑）組，RGCs中加壓+20mmol/lLicl組。采用免疫熒光方法檢測RGCs中磷酸化絲氨酸9位點(diǎn)GSK3β(pS9-GSK3β)的表達(dá)情況，MTT檢測RGCs細(xì)胞活性。 【結(jié)果】加壓組pS9-GSK3β表達(dá)的熒光密度(MOD值=0.057 0.012)較對(duì)照組(MOD值=0.085 0.023)明顯降低(p0.05)，而加壓+10mmol/LLicl組和加壓+20mmol/L Licl組pS9-GSK3β表達(dá)的熒光密度(MOD值分別為0.081 0.016和0.099 0.024)均較加壓組(MOD值=0.057 0.012)增大(p0.05)，且隨著Licl濃度的增加，pS9-GSK3β表達(dá)的熒光密度增大（MOD值20mmol/l Licl=0.099 0.024MOD值10mmol/l Licl=0.081 0.016）(p0.05)。MTT結(jié)果顯示，加壓組細(xì)胞活性（OD值=0.109 0.016）較對(duì)照組（OD值=0.135 0.015）顯著降低（p0.05），而加壓+20mmol/LLicl組中細(xì)胞活性（OD值=0.159 0.014）較加壓組（OD值=0.109 0.016）顯著升高（p0.05）。 【結(jié)論】壓力培養(yǎng)下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中pS9-GSK3β表達(dá)減少提示GSK3β被激活，RGCs細(xì)胞活性減低。Licl作為GSK3β的抑制劑，對(duì)RGCs有保護(hù)作用。 第二部分糖原合酶激酶3β在大鼠慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中作用的研究 【目的】探討GSK3β在慢性高眼壓模型中對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用。 【方法】采用鼠眼全周鞏膜上靜脈結(jié)扎燒灼+全周角鞏緣毛細(xì)血管灼燒術(shù)法誘導(dǎo)大鼠慢性高眼壓模型，根據(jù)高眼壓維持時(shí)間分成：慢性高眼壓2周組和慢性高眼壓4周組；每組再由氯化鋰作用濃度分為三個(gè)小組：單純慢性高眼壓組、2mmol/kg氯化鋰慢性高眼壓組、3mmol/kg氯化鋰慢性高眼壓組，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組，每組8只大鼠。氯化鋰組采用每日腹腔注射0.5ml，而正常對(duì)照及單純慢性高眼壓模型每日腹腔注射生理鹽水0.5ml。慢性高眼壓模型術(shù)前、術(shù)后當(dāng)天、術(shù)后3d、7d、14d、21d、28d監(jiān)測眼壓，眼壓穩(wěn)定在26±2mmHg直至到達(dá)規(guī)定時(shí)間止，每只鼠單側(cè)眼取新鮮視網(wǎng)膜行Western blot檢測total-GSK3β及pS9-GSK3β表達(dá)量，再灌注固定后另一側(cè)眼行冰凍切片，免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層pS9-GSK3β的表達(dá)情況。同時(shí)用neun標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，熒光顯微鏡下分別對(duì)不同分組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)。 【結(jié)果】正常對(duì)照和慢性高眼壓模型視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層中均表達(dá)總GSK3β（t-GSK3β）。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層pS9-GSK3β表達(dá)較慢性高眼壓模型組增多（p0.01），慢性高眼壓2周組較慢性高眼壓4周組pS9-GSK3β表達(dá)減少(p0.01)。視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)目在正常組較慢性高眼壓模型組多(p0.01)，且隨高眼壓作用時(shí)間延長，節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少(p0.01)。同一時(shí)間段氯化鋰作用組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層pS9-GSK3β表達(dá)量較單純高眼壓組增多，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目增多，且隨著氯化鋰濃度的增加，pS9-GSK3β表達(dá)量增多(p0.01)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目也增多(p0.05)。 【結(jié)論】在慢性高眼壓模型鼠眼中,GSK3β活化，氯化鋰作為GSK3β的抑制劑可以增加pS9-GSK3β的量，使GSK3β活性下降，對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞有保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 觀 察 各 組R G Cs 的 p S9 -G S K 3 β表 達(dá)情 況（ b a r： 2 0μ m ）A 對(duì) 照 組 ； B 加 壓 組 ；C 加 壓+ 1 0 mm o l /l L i c l 組 ； D 加 壓 +2 0 mm o l/ l Li c l 組※p < 0 . 0 5 vs B 組 ，* p <0 . 0 5 vs C 組 /D 組 ，* * p <0 . 0 5 vs D 組表 1 不 同組 R GC s 的活 性情 況 （ x ± s）

co n t ro l 圖 2 各 組視 網(wǎng)膜 神 經(jīng) 節(jié)細(xì) 胞數(shù) 量 觀 察 （N e u n ，b a r： 1 0 0μ m ）A 對(duì) 照組 ； B1 高 眼 壓 2 w 組 ； B2 高 眼壓 2 w +l i c l 2 mm o l/ k g 組 ；B3 高 眼壓 2 w +l i c l 3 mm o l/ k g組； C 1 高 眼壓 4 w 組 ；C 2 高 眼壓 4 w +l i c l 2 mm o l/ k g組； C 3 高 眼壓 4 w +l i c l 3 mm o l/ k g 組。 箭 頭所 指為 視 網(wǎng)膜 神經(jīng) 節(jié)細(xì) 胞， # p <0 . 01 vs B1 /C 1 ，同 時(shí)間 組*p <0 . 0 1 vs B2 B3 /C 2 C 3 ， ** p < 0 . 0 5 vs B3 /C 3 。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R775

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡梁凌;曾慶杏;;氯化鋰阻斷大鼠海馬注射溶血磷脂酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元Tau蛋白磷酸化[J];武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年02期

2 張芳;陳彥;吳健;;氯化鋰對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的作用[J];中國校醫(yī);2006年05期

本文編號(hào)：2535788