【摘要】： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國(guó)南方常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均居世界首位,嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命和健康。放療是NPC的主要治療手段。雖然放療設(shè)備和方法不斷改進(jìn),但NPC療效無(wú)明顯改善。放療失敗的主要原因是NPC組織中存在一定比例的放療抗拒細(xì)胞,放療后殘留的這些腫瘤細(xì)胞不僅放射抗拒性增強(qiáng),而且更具侵襲性、容易發(fā)生淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,放療抗拒仍然是制約NPC療效的瓶頸。但NPC放射抗拒的分子機(jī)制不太清楚。尋找NPC放射抗拒相關(guān)的蛋白質(zhì),不僅有助于揭示NPC放療抗拒的機(jī)制,而且能為NPC放療敏感性預(yù)測(cè)以及NPC的靶向和個(gè)體化治療提供科學(xué)依據(jù),對(duì)提高NPC的療效、改善NPC預(yù)后具有重要作用。 為篩選NPC放療抗拒相關(guān)的蛋白質(zhì),我們采用亞致死劑量放射線反復(fù)照射法建立了放射抗拒的NPC細(xì)胞株CNE2-IR,該細(xì)胞系來源于NPC細(xì)胞株CNE2,為接受5次亞致死劑量放射線(11Gy)照射后存活的亞克隆細(xì)胞。然后采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較放射抗拒CNE2-IR細(xì)胞與放射敏感CNE2細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異,篩選NPC的放療抗拒相關(guān)蛋白質(zhì)。即應(yīng)用二維凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分離兩株細(xì)胞的總蛋白質(zhì),PDQuest軟件分析識(shí)別差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn),基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS／MS)鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。Western blot對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)篩選到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。 建立了高質(zhì)量的放射抗拒CNE2-IR細(xì)胞與放射敏感CNE2細(xì)胞的2-DE圖譜,質(zhì)譜共鑒定出34種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中14-3-3σ和Maspin表達(dá)在放射抗拒的CNE2-IR細(xì)胞中明顯下調(diào),而GRP78和Mn-SOD表達(dá)明顯上調(diào)。應(yīng)用Western blot驗(yàn)證了4種蛋白質(zhì)(14-3-3σ、Maspin、GRP78和Mn-SOD)在CNE2-IR和CNE2細(xì)胞株中的差異表達(dá)水平。 為了探討差異表達(dá)蛋白質(zhì)能否作為預(yù)測(cè)NPC放療敏感性的分子標(biāo)志,采用免疫組化檢測(cè)差異蛋白14-3-3σ、Maspin、GRP78和Mn-SOD在39例放射抗拒和51例放射敏感NPC組織中的表達(dá),采用ROC(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲線分析4個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)NPC放療敏感性的價(jià)值。結(jié)果顯示,與放療敏感的NPC組織比較,14-3-3σ和Maspin表達(dá)在放射抗拒NPC組織中明顯下調(diào),而GRP78和Mn-SOD表達(dá)明顯上調(diào)。14-3-3σ和Maspin表達(dá)下調(diào),以及GRP78和Mn-SOD表達(dá)上調(diào)與NPC放射抗拒性有明顯的相關(guān)性；4個(gè)蛋白質(zhì)組合判別放射敏感與放射抗拒NPC的敏感性為90%、特異性為88%。 為進(jìn)一步證實(shí)4個(gè)差異蛋白質(zhì)在NPC放射抗拒產(chǎn)生中的作用,我們選擇差異蛋白質(zhì)14-3-3σ進(jìn)行功能分析。既采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)14-3-3σ在CNE2-IR細(xì)胞中的表達(dá),采用克隆存活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)14-3-3σ表達(dá)上調(diào)對(duì)其放療敏感性的影響。結(jié)果顯示,14-3-3σ表達(dá)上調(diào)可部分逆轉(zhuǎn)CNE2-IR細(xì)胞的放射抗拒性,這提示14-3-3σ在NPC放射抗拒產(chǎn)生中具有重要的作用。 本文研究結(jié)果表明,14-3-3σ、Maspin、GRP78和Mn-SOD蛋白是預(yù)測(cè)NPC放療敏感性的潛在生物標(biāo)志物,它們表達(dá)失調(diào)可能參與NPC放射抗拒性的產(chǎn)生。
【圖文】：

CNEZ細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，12小時(shí)后用。一loGy的x射線照射，培養(yǎng)12天后用0.4%結(jié)晶紫染色，在鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算存活分?jǐn)?shù)，繪制劑量存活曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果如圖1一1所示，CNEZ一IR細(xì)胞的存活克隆比對(duì)照CNEZ的克隆更大、數(shù)目更多，表現(xiàn)為放射抗拒。劑量存活曲線分析結(jié)果如圖1一2所示，CNEZ細(xì)胞的劑量存活分?jǐn)?shù)曲線下降趨勢(shì)較快，CNEZ一IR細(xì)胞的劑量存活分?jǐn)?shù)曲線下降趨勢(shì)較慢。在10%和1%同生存分?jǐn)?shù)水平時(shí)，CNEZ一IR與CNEZ比較的劑量修飾因子 (dosemodifyingfactors，DMFs)分別為2.04和 1.56�？寺〈婊顚�(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CNEZ一IR細(xì)胞的放射敏感性明顯低于CNEZ細(xì)胞

分州鉀如娜確冷急氣3廠筍一293火，于34、\、圖2一 1CNEZ一IR和CNEZ細(xì)胞的總蛋白雙向凝膠電泳2一DE圖譜.箭頭所指為質(zhì)譜鑒定的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)表2一 1CNEZ一IR和CNEZ細(xì)胞之間34個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)水平 NormalizedVolume(PPm) SPotNo.Swiss一 ProtACCNEZ一IRCNEZP一valueQgY4LI Pl11426293士798.16521.4士133.27 8.OIE一099064
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2534478