【摘要】：目的 1、探討利用細(xì)胞因子誘生法,分離、提純、培養(yǎng)大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞,研究白介素-10作用于樹突狀細(xì)胞后,樹突狀細(xì)胞表型及功能的變化。 2、建立大鼠穿透性角膜移植模型,研究未成熟樹突狀細(xì)胞在大鼠角膜移植排斥反應(yīng)中的作用,尋找抑制角膜移植排斥反應(yīng)的新方法。 3、通過RT-PCR方法和組織病理學(xué)檢查,分別觀察角膜移植術(shù)后第14天各組角膜IL-12、Th1/Th2細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況和角膜的病理學(xué)改變,探討未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受的機(jī)制。 方法 1、用大鼠淋巴細(xì)胞分離液提取大鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞,以細(xì)胞因子誘生法進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng),在樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)至第6天,將實(shí)驗(yàn)分為3組:培養(yǎng)至6天的DC即6-DC組;繼續(xù)培養(yǎng)至12天的DC即12-DC組;在第6天加入IL-10,繼續(xù)培養(yǎng)至第12天即IL-10-DC組。通過流式細(xì)胞儀比較骨髓源樹突狀細(xì)胞成熟的特異性標(biāo)志CD83和細(xì)胞表面共刺激分子CD86的表達(dá);通過MTT法,比較樹突狀細(xì)胞刺激同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力。 2、取供體Wistar大鼠骨髓進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),將受體鼠隨機(jī)分為3組:陽性對照組、6-DC組及IL-10-DC組,每組8只。分別于角膜移植術(shù)前3天尾靜脈注射PBS、6-DC及IL-10-DC。術(shù)后每天對角膜植片進(jìn)行臨床觀察,計(jì)算排斥反應(yīng)指數(shù)并記錄角膜植片存活時(shí)間。 3、實(shí)驗(yàn)分為4組,陰性對照組5只(10眼),為未經(jīng)任何處理的SD大鼠;陽性對照組、6-DC組和IL-10-DC組各10只,分別于角膜移植術(shù)前3天受體鼠尾靜脈注射PBS、6-DC及IL-10-DC。于術(shù)后14天,應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組角膜IL-12、Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10 mRNA的表達(dá),并行角膜組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果 1、樹突狀細(xì)胞前體細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則,沒有突起;培養(yǎng)至第2天,細(xì)胞體積增大,開始呈集落聚集,細(xì)胞表面出現(xiàn)面紗狀或樹枝狀的突起;培養(yǎng)至第6天,細(xì)胞從集落分散,細(xì)胞體積更大,具有典型的樹突狀細(xì)胞的形態(tài)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:IL-10-DC組CD83、CD86最低,12-DC組CD83、CD86最高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。MTT結(jié)果顯示:IL-10-DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力最弱,12-DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 2、陽性對照組、6-DC組、IL-10-DC組角膜植片的存活時(shí)間分別是10.63±2.00d、18.88±1.36d、24.50±2.07d,6-DC組、IL-10-DC組與陽性對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);IL-10-DC組角膜植片存活時(shí)間與6-DC組比較顯著延長(P0.01)。術(shù)后第14天陽性對照組、6-DC組、IL-10-DC組的排斥反應(yīng)指數(shù)分別為6.44±1.43、2.38±0.92、2.00±0.71,6-DC組、IL-10-DC組與陽性對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),IL-10-DC組較6-DC組有降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3、RT-PCR結(jié)果顯示,陰性對照組(正常大鼠)角膜IL-12及Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ見微量表達(dá),Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10呈高表達(dá)。在陽性對照組中IL-12及Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γmRNA顯著高表達(dá),而Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10呈低表達(dá)。與陽性對照組比較,各實(shí)驗(yàn)組IL-12和Th1細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.01),Th2細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平顯著增高(P0.01);IL-10-DC組與6-DC組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查,陽性對照組角膜植片明顯增厚,基質(zhì)層纖維結(jié)構(gòu)紊亂,植片中有大量炎細(xì)胞浸潤,可見到新生血管。6-DC組、IL-10-DC組炎癥反應(yīng)輕,無新生血管長入。 結(jié)論 1、通過細(xì)胞因子誘生法,成功培養(yǎng)了大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞。IL-10能降低大鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞成熟特異性標(biāo)志CD83和共刺激分子CD86的表達(dá),抑制樹突狀細(xì)胞的成熟。 2、未成熟樹突狀細(xì)胞能延長角膜植片存活時(shí)間,誘導(dǎo)免疫耐受。IL-10-DC誘導(dǎo)免疫耐受的效果更好。 3、Th1細(xì)胞因子和IL-12在角膜移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,而Th2細(xì)胞因子在抑制角膜移植排斥反應(yīng)中起重要作用。誘導(dǎo)Th1/Th2偏離,抑制角膜炎癥反應(yīng)是未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受的機(jī)制之一。
【圖文】：

圖 1 大鼠脛、腓骨 圖 2 沖洗后大鼠脛骨圖 3 淋巴細(xì)胞液分層 圖 4 第 4 天細(xì)胞（×200）最上面一層紅色為血漿，箭頭標(biāo)注的絮 細(xì)胞呈集落生長，集落較大，，細(xì)胞表面狀層為單個(gè)核細(xì)胞，第 3 層透明層為淋 可見毛刺狀突起巴細(xì)胞分離液，管底為紅細(xì)胞

圖 1 大鼠脛、腓骨 圖 2 沖洗后大鼠脛骨圖 3 淋巴細(xì)胞液分層 圖 4 第 4 天細(xì)胞（×200）最上面一層紅色為血漿，箭頭標(biāo)注的絮 細(xì)胞呈集落生長，集落較大，細(xì)胞表面狀層為單個(gè)核細(xì)胞，第 3 層透明層為淋 可見毛刺狀突起巴細(xì)胞分離液，管底為紅細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R779.65

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本文編號：2528908