間充質干細胞在前房相關免疫偏離中作用的研究
發(fā)布時間:2019-08-02 11:33
【摘要】:目的 前房相關免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation, ACAID)是指引入前房內的抗原所誘導出的一種免疫偏離反應,其特征是抗原特異性的Thl免疫應答,如遲發(fā)型超敏反應和補體固定性抗體受到抑制,但卻保留了非補體固定性抗體,即IgG1亞型的產生。它是角膜特有的免疫赦免機制之一,是角膜植片長期存活的主要因素;能夠避免自身免疫性疾病和單皰病毒性基質型角膜炎。間充質干細胞(messenchymal stem cells,MSCs)能夠抑制多種免疫細胞(包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及樹突狀細胞)的增殖和功能,具有免疫調控和誘導免疫耐受的作用。本研究旨在通過小鼠前房相關免疫偏離動物模型,觀察MSCs在前房相關免疫偏離小鼠體內是否能夠發(fā)揮免疫調控作用,以及其可能的作用機制,為臨床治療角膜移植排斥反應和自身免疫性葡萄膜炎等眼病提供理論依據(jù)。 方法 1、人臍帶間充質干細胞(hMSCs)的培養(yǎng)和擴增。 2、制作小鼠前房相關免疫偏離動物模型,C57BL/6小鼠隨機分為4組,前房相關免疫偏離組(A組)、前房相關免疫偏離+MSCs組(B組),皮下免疫組(C組)和皮下免疫±MSCs組(D組),共4組。A、B兩組將2μ1卵白蛋白(OVA,50mg/ml)行前房注射,C、D組予2μ1 PBS前房注射,B、D組前房注射同時給予尾靜脈注射1×106/0.2ml MSCs,7d后4組均行足底皮下免疫OVA100μ1(2.5mg/mlOVA與CFA等體積充分乳化)。 3、動物模型制作后14d用工程游標卡尺(精確度為0.01mm)測量4組小鼠雙耳廓厚度,然后于小鼠右耳廓皮內注射20μLOVA溶液(20mg/mL),左耳廓皮內注射20μL無菌PBS溶液。24h后,再用工程游標卡尺測量4組小鼠雙耳廓厚度,按照下述公式計算耳廓腫脹數(shù)值。公式為:遲發(fā)型超敏反應耳廓腫脹數(shù)值=(24h右耳廓厚度值-Oh右耳廓厚度值)-(24h左耳廓厚度值-Oh左耳廓厚度值)(gm)。 4、取造模后15d各組小鼠脾臟淋巴細胞孵育48h后的上清液,采用ELISA試劑盒測定上清液中IL-10、TGF-β、IFN-γ水平。 5、取造模后15d各組小鼠脾臟淋巴細胞,流式細胞儀測定CD4+CD25+Foxp3+ CD8+Foxp3+調節(jié)性T細胞的百分比。 結果 1、hMSCs生長良好,鏡下觀察細胞長梭形,呈排列緊密的漩渦樣結構,培養(yǎng)近5代后,細胞的形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化,其增殖趨勢也保持明顯穩(wěn)定。 2、成功建立小鼠前房相關免疫偏離動物模型。 3、遲發(fā)型超敏反應檢測:A、B兩組的小鼠耳廓腫脹程度遠遠小于C組(P0.05),證明ACAID造模成功。A、B兩組耳廓腫脹程度無差別(P0.05),無統(tǒng)計學意義,C、D兩組耳廓腫脹程度無差別(P0.05)。 4、ELISA結果:IL-10 B組較A、C、D組水平升高(P0.05),C與D組之間無統(tǒng)計學意義;TGF-βB組比A、C、D組水平升高(P0.05),D組比C組水平升高(P0.05);IFN-γB組較A、C、D組水平降低(P0.05),D組比C組水平降低(P0.05)。 5、流式細胞分析結果:B組脾細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞在CD4+T細胞中的比例和CD8+Foxp3+T細胞在CD8+T細胞中的比例均較A、C、D組升高(P0.05),而C組和D組在這兩方面均無統(tǒng)計學意義。 結論 MSCs通過調節(jié)Th1/Th2細胞因子的分泌,以及激活或上調調節(jié)性T細胞來發(fā)揮其免疫抑制作用。本研究證實MSCs可進一步抑制前房相關免疫偏離抗原特異性DTH反應的發(fā)生,促進前房相關免疫偏離的免疫耐受狀態(tài)的維持。從而減小了機體針對抗原產生的免疫反應對眼球的破壞,為角膜移植術后排斥反應及葡萄膜炎的治療提供了理論依據(jù)。
【圖文】:
圖1工程游標卡尺(精確度0.01mm)胞因子測定模后15d各組小鼠脾臟淋巴細胞孵育48h后的上清液,采用EL清液中IL一10、TGF一6、IFN一Y水平。具體原理、步驟及結果計:木實驗采用雙抗體夾心ABC一ELISA法。以IL一10為例,用抗小十酶標板上,標準品和樣品中的IL一10與單抗結合,加入牛物素一10,形成免疫復合物連接在板卜,辣根過氧化物酶標記的str結合,力[]入底物工作液顯藍色,最后加終止液硫酸,在450nm濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標木中IL一10IFN一Y原理同上。:木:造模后15d,,斷髓處死小鼠,75%酒精浸泡20min。凈臺內無菌取出脾臟,用lmL注射器將脾臟頭尾兩端各扎一針,
天津醫(yī)科大學碩士學位論文結3.2.遲發(fā)型超敏反應檢測表1各組小鼠耳廓腫脹反應數(shù)值TablEarswe1lingmeasurementamongthegrouPs分組數(shù)量(只)A組(ACAID組)B組(ACAID+MSCs組)C組(皮下免疫組)D組(皮下免疫十MSCs組)平均耳廓厚度(林m)29.22士1‘4128.80士1.4767.33士1.6463.57士1.52<0.05<0.05n村八口n
本文編號:2522090
【圖文】:
圖1工程游標卡尺(精確度0.01mm)胞因子測定模后15d各組小鼠脾臟淋巴細胞孵育48h后的上清液,采用EL清液中IL一10、TGF一6、IFN一Y水平。具體原理、步驟及結果計:木實驗采用雙抗體夾心ABC一ELISA法。以IL一10為例,用抗小十酶標板上,標準品和樣品中的IL一10與單抗結合,加入牛物素一10,形成免疫復合物連接在板卜,辣根過氧化物酶標記的str結合,力[]入底物工作液顯藍色,最后加終止液硫酸,在450nm濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標木中IL一10IFN一Y原理同上。:木:造模后15d,,斷髓處死小鼠,75%酒精浸泡20min。凈臺內無菌取出脾臟,用lmL注射器將脾臟頭尾兩端各扎一針,
天津醫(yī)科大學碩士學位論文結3.2.遲發(fā)型超敏反應檢測表1各組小鼠耳廓腫脹反應數(shù)值TablEarswe1lingmeasurementamongthegrouPs分組數(shù)量(只)A組(ACAID組)B組(ACAID+MSCs組)C組(皮下免疫組)D組(皮下免疫十MSCs組)平均耳廓厚度(林m)29.22士1‘4128.80士1.4767.33士1.6463.57士1.52<0.05<0.05n村八口n
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