【摘要】：目的 前房相關(guān)免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation, ACAID)是指引入前房內(nèi)的抗原所誘導(dǎo)出的一種免疫偏離反應(yīng),其特征是抗原特異性的Thl免疫應(yīng)答,如遲發(fā)型超敏反應(yīng)和補(bǔ)體固定性抗體受到抑制,但卻保留了非補(bǔ)體固定性抗體,即IgG1亞型的產(chǎn)生。它是角膜特有的免疫赦免機(jī)制之一,是角膜植片長期存活的主要因素；能夠避免自身免疫性疾病和單皰病毒性基質(zhì)型角膜炎。間充質(zhì)干細(xì)胞(messenchymal stem cells,MSCs)能夠抑制多種免疫細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞)的增殖和功能,具有免疫調(diào)控和誘導(dǎo)免疫耐受的作用。本研究旨在通過小鼠前房相關(guān)免疫偏離動物模型,觀察MSCs在前房相關(guān)免疫偏離小鼠體內(nèi)是否能夠發(fā)揮免疫調(diào)控作用,以及其可能的作用機(jī)制,為臨床治療角膜移植排斥反應(yīng)和自身免疫性葡萄膜炎等眼病提供理論依據(jù)。 方法 1、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)的培養(yǎng)和擴(kuò)增。 2、制作小鼠前房相關(guān)免疫偏離動物模型,C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組,前房相關(guān)免疫偏離組(A組)、前房相關(guān)免疫偏離+MSCs組(B組),皮下免疫組(C組)和皮下免疫±MSCs組(D組),共4組。A、B兩組將2μ1卵白蛋白(OVA,50mg/ml)行前房注射,C、D組予2μ1 PBS前房注射,B、D組前房注射同時給予尾靜脈注射1×106/0.2ml MSCs,7d后4組均行足底皮下免疫OVA100μ1(2.5mg/mlOVA與CFA等體積充分乳化)。 3、動物模型制作后14d用工程游標(biāo)卡尺(精確度為0.01mm)測量4組小鼠雙耳廓厚度,然后于小鼠右耳廓皮內(nèi)注射20μLOVA溶液(20mg/mL),左耳廓皮內(nèi)注射20μL無菌PBS溶液。24h后,再用工程游標(biāo)卡尺測量4組小鼠雙耳廓厚度,按照下述公式計算耳廓腫脹數(shù)值。公式為：遲發(fā)型超敏反應(yīng)耳廓腫脹數(shù)值=(24h右耳廓厚度值-Oh右耳廓厚度值)-(24h左耳廓厚度值-Oh左耳廓厚度值)(gm)。 4、取造模后15d各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞孵育48h后的上清液,采用ELISA試劑盒測定上清液中IL-10、TGF-β、IFN-γ水平。 5、取造模后15d各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測定CD4+CD25+Foxp3+ CD8+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比。 結(jié)果 1、hMSCs生長良好,鏡下觀察細(xì)胞長梭形,呈排列緊密的漩渦樣結(jié)構(gòu),培養(yǎng)近5代后,細(xì)胞的形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化,其增殖趨勢也保持明顯穩(wěn)定。 2、成功建立小鼠前房相關(guān)免疫偏離動物模型。 3、遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測：A、B兩組的小鼠耳廓腫脹程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于C組(P0.05),證明ACAID造模成功。A、B兩組耳廓腫脹程度無差別(P0.05),無統(tǒng)計學(xué)意義,C、D兩組耳廓腫脹程度無差別(P0.05)。 4、ELISA結(jié)果：IL-10 B組較A、C、D組水平升高(P0.05),C與D組之間無統(tǒng)計學(xué)意義；TGF-βB組比A、C、D組水平升高(P0.05),D組比C組水平升高(P0.05)；IFN-γB組較A、C、D組水平降低(P0.05),D組比C組水平降低(P0.05)。 5、流式細(xì)胞分析結(jié)果：B組脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例和CD8+Foxp3+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞中的比例均較A、C、D組升高(P0.05),而C組和D組在這兩方面均無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 MSCs通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌,以及激活或上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來發(fā)揮其免疫抑制作用。本研究證實MSCs可進(jìn)一步抑制前房相關(guān)免疫偏離抗原特異性DTH反應(yīng)的發(fā)生,促進(jìn)前房相關(guān)免疫偏離的免疫耐受狀態(tài)的維持。從而減小了機(jī)體針對抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對眼球的破壞,為角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)及葡萄膜炎的治療提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

圖1工程游標(biāo)卡尺(精確度0.01mm)胞因子測定模后15d各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞孵育48h后的上清液，采用EL清液中IL一10、TGF一6、IFN一Y水平。具體原理、步驟及結(jié)果計:木實驗采用雙抗體夾心ABC一ELISA法。以IL一10為例，用抗小十酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL一10與單抗結(jié)合，加入牛物素一10，形成免疫復(fù)合物連接在板卜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的str結(jié)合，力[]入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450nm濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)木中IL一10IFN一Y原理同上。:木:造模后15d，，斷髓處死小鼠，75%酒精浸泡20min。凈臺內(nèi)無菌取出脾臟，用lmL注射器將脾臟頭尾兩端各扎一針，

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié)3.2.遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測表1各組小鼠耳廓腫脹反應(yīng)數(shù)值TablEarswe1lingmeasurementamongthegrouPs分組數(shù)量(只)A組(ACAID組)B組(ACAID+MSCs組)C組(皮下免疫組)D組(皮下免疫十MSCs組)平均耳廓厚度(林m)29.22士1‘4128.80士1.4767.33士1.6463.57士1.52<0.05<0.05n村八口n

本文編號：2522090