【摘要】：角膜是構(gòu)成眼屈光間質(zhì)的重要組成部分,同時(shí)也是重要的天然防御屏障。目前,全球約有超過1000萬人承受著角膜盲的痛苦。迄今為止,同種異體角膜移植是治療角膜盲最有效的手段。然而,由于供體材料的匱乏,遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了角膜盲患者的需求。因此,尋找有效的角膜替代物用于角膜移植,是目前眼科界亟待解決的問題。早期的角膜替代物研究多集中于人工角膜(Keratoprosthesis),有些已應(yīng)用于臨床,然而因生物相容性差、術(shù)后并發(fā)癥較多等原因,限制了其在臨床的應(yīng)用。 組織工程人工角膜是近年來研究熱點(diǎn),由種子細(xì)胞和可降解支架材料經(jīng)體外構(gòu)建而成,可最大程度地模仿天然角膜結(jié)構(gòu)和功能。國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者采用天然或人工合成材料進(jìn)行組織工程角膜構(gòu)建,取得了較大進(jìn)展,但因該構(gòu)建物機(jī)械力學(xué)性能不足以及光學(xué)特性不佳等原因僅能用于基礎(chǔ)研究。有報(bào)道證實(shí),采用天然的材料如動(dòng)物或人膠原制作支架可以增強(qiáng)其生物相容性。一些異種來源的細(xì)胞外基質(zhì)己成功用于構(gòu)建人工器官,如皮膚、心臟、血管等。我們課題組前期研究也證實(shí),0.5% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)處理的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(Acellular Porcine Cornea Matrix, APCM)具有較好的透光性、力學(xué)性能、生物安全性及生物相容性,細(xì)胞及遺傳物質(zhì)被去除的同時(shí),角膜的天然結(jié)構(gòu)得到了良好的保留。然而,APCM能否應(yīng)用于組織工程人工角膜構(gòu)建并用于移植是本研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。鑒于角膜板層移植是治療一些常見角膜病的有效手段,同時(shí)能夠避免角膜內(nèi)皮損傷和排斥,本研究主要開展了以異種脫細(xì)胞角膜支架進(jìn)行組織工程兔角膜前板層構(gòu)建的研究,并成功進(jìn)行動(dòng)物角膜板層移植,取得了較好的效果,目前國(guó)內(nèi)外尚無類似研究報(bào)道。 第一部分兔角膜細(xì)胞的培養(yǎng)及APCM的制備 [目的]探討應(yīng)用無血清培養(yǎng)基KSFM培養(yǎng)兔角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞的可行性,同時(shí)對(duì)脫細(xì)胞方法進(jìn)行改良以制備APCM用于組織工程人工角膜前板層構(gòu)建。 [方法]1.兔角膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)：無菌條件下獲取新西蘭大白兔眼角膜,仔細(xì)去除虹膜、結(jié)膜及多余鞏膜,解剖顯微鏡下撕下內(nèi)皮層用于組織塊培養(yǎng)；將去內(nèi)皮角膜組織置于2.4U/ml DispaseⅡ消化1h,獲取角膜上皮片,經(jīng)0.25%胰酶-0.02%EDTA獲取上皮細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)；剩余角膜基質(zhì)剪碎成1mm×1mm大小,置于0.5mg/ml膠原酶I 37℃消化過夜,獲取基質(zhì)細(xì)胞懸液。將3種細(xì)胞各分為2組,即KSFM培養(yǎng)組和含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)組,置于六孔板內(nèi)培養(yǎng),每種細(xì)胞每組3個(gè)孔,各接種8個(gè)板,觀察各培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞計(jì)數(shù)法描記生長(zhǎng)曲線； 2. APCM的制備及去細(xì)胞效果檢測(cè)：改良脫細(xì)胞制作方法,無菌條件下將處理后的新鮮豬角膜置于0.5%SDS溶液4℃振搖4h×6次,不含雙抗PBS沖洗2h×8次,含雙抗PBS沖洗1h×3-6次獲取無菌APCM,進(jìn)行以下檢測(cè)：1)H.E.及DAPI檢測(cè)脫細(xì)胞角膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞及遺傳物質(zhì)的殘留；2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料浸提液對(duì)角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響；3)電鏡觀察材料的結(jié)構(gòu)及有無細(xì)胞殘留。 [結(jié)果]1.1)KSFM組：培養(yǎng)2d,上皮細(xì)胞形成克隆團(tuán),基質(zhì)細(xì)胞貼壁呈樹枝狀,內(nèi)皮細(xì)胞未見爬出；培養(yǎng)7d,上皮細(xì)胞緊密連接呈片狀(密度達(dá)到90%-100%),基質(zhì)細(xì)胞呈樹枝狀(密度達(dá)70-80%),內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密,形態(tài)不規(guī)則；傳代后,細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng),漂浮細(xì)胞較多；2)含10%FBS的DMEM/F12組：培養(yǎng)2d,上皮細(xì)胞形成克隆團(tuán),基質(zhì)細(xì)胞呈梭形,內(nèi)皮細(xì)胞可見有少量細(xì)胞爬出；培養(yǎng)5d,上皮呈鵝卵石樣已達(dá)60%密度,基質(zhì)細(xì)胞呈梭形達(dá)70-80%密度,可見大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞從內(nèi)皮片組織周邊爬出,呈不規(guī)則狀；上皮和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)7d傳代,內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)10d后傳代,生長(zhǎng)狀態(tài)均良好,基質(zhì)細(xì)胞可傳10代。KSFM培養(yǎng)的上皮和基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與含血清培養(yǎng)基相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)APCM浸提液對(duì)角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線無影響(P0.05)；H.E.及DAPI證實(shí)材料內(nèi)無細(xì)胞成分殘留；電鏡示材料結(jié)構(gòu)完整,膠原排列整齊。 [結(jié)論]KSFM可用來培養(yǎng)角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞,但細(xì)胞生長(zhǎng)較緩慢,易死亡；APCM經(jīng)改良的脫細(xì)胞方法處理效果良好,可用來進(jìn)行組織工程人工角膜構(gòu)建。 第二部分組織工程兔角膜前板層的體外構(gòu)建 [目的]探討以APCM為支架體外構(gòu)建含角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的組織工程兔角膜前板層的可行性。 [方法]解剖顯微鏡下獲取含前彈力層的APCM薄片(厚約1-2mm、直徑7mm),置于培養(yǎng)基內(nèi)37℃下浸泡24h,以備接種細(xì)胞。胰酶消化獲取3代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞終濃度為5×105/ml,應(yīng)用1ml胰島素空針平行于APCM前彈力層平面,將1ml基質(zhì)細(xì)胞懸液沿著材料邊緣接種于內(nèi)靜置培養(yǎng)24h,而后置于搖床上振搖培養(yǎng)7d；將1代角膜緣上皮細(xì)胞以5×103/mm2的密度接種于構(gòu)建物表面,等待2h待細(xì)胞貼附于材料表面后,輕輕添加培養(yǎng)基靜置再培養(yǎng)7d,構(gòu)建同時(shí)含角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的組織工程兔角膜前板層。將接種基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)8d后的構(gòu)建物再貼壁培養(yǎng)7d,觀察有無細(xì)胞從角膜周邊爬出,間接鑒定構(gòu)建物內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞活性；分別于3d、8d、15d取材進(jìn)行H.E.染色,觀察構(gòu)建物細(xì)胞生長(zhǎng)情況及組織結(jié)構(gòu)；免疫染色檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CK3和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)；取15d構(gòu)建物標(biāo)本分別進(jìn)行免疫染色檢查和掃描電鏡觀察。兔角膜前板層的三維構(gòu)建過程均采用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。 [結(jié)果]構(gòu)建物再貼壁培養(yǎng)5d,可見有大量基質(zhì)細(xì)胞爬出,間接證實(shí)材料內(nèi)細(xì)胞活性。H.E.染色示構(gòu)建物結(jié)構(gòu)完整,未見明顯的結(jié)構(gòu)改變,膠原纖維間隙較大：3d,可見基質(zhì)內(nèi)有細(xì)胞生長(zhǎng),密度分布不均勻,膠原排列較規(guī)則；8d,可見基質(zhì)內(nèi)生長(zhǎng)大量細(xì)胞,密度較均勻,膠原纖維間隙較大,排列整齊；15d,材料內(nèi)仍分布大量細(xì)胞,表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin,密度較均勻,材料表面有2-3層細(xì)胞,表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK3,膠原排列整齊,纖維間隙較大。掃描電鏡示膠原纖維水腫膨脹明顯,部分區(qū)域見有膠原纖維斷裂,膠原排列較整齊,可見有梭形的基質(zhì)細(xì)胞附著生長(zhǎng)。經(jīng)過100%無菌甘油脫水,構(gòu)建物能夠恢復(fù)透明,表明APCM經(jīng)過細(xì)胞接種再培養(yǎng)過程,三維結(jié)構(gòu)保持良好。 [結(jié)論]APCM可用于組織工程人工角膜的構(gòu)建；構(gòu)建物具有正常兔角膜的表型,且脫水后能恢復(fù)透明,驗(yàn)證了該三維培養(yǎng)方法的可行性,為兔角膜全層和人角膜的構(gòu)建奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分組織工程兔角膜前板層的動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn) [目的]初步探討體外構(gòu)建的兔角膜前板層體內(nèi)移植后的生物學(xué)功能。 [方法]1.5～2 kg新西蘭大白兔20只隨機(jī)分為兩組,即構(gòu)建物移植組和APCM空支架組,每組10只,各組均以右眼做術(shù)眼,左眼做陰性對(duì)照。術(shù)前3d術(shù)眼滴用抗生素,3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)經(jīng)耳緣靜脈進(jìn)行麻醉,含慶大霉素生理鹽水沖洗結(jié)膜囊,制備6.5mm直徑大小角膜植床,采用國(guó)產(chǎn)10-0尼龍線對(duì)位縫合7mm直徑大小植片至植床(共16針),并覆蓋羊膜,結(jié)膜下隔日注射慶大霉素及地塞米松,合并應(yīng)用典舒眼水(3次/天),構(gòu)建物移植組術(shù)后1個(gè)月拆線。分別于1d、3d、7d、14d、21d、28d觀察以下指標(biāo)：結(jié)膜充血、水腫、分泌物,角膜水腫、混濁、浸潤(rùn)、新生血管、炎癥反應(yīng),熒光素染色觀察角膜上皮的完整性；術(shù)后5周進(jìn)行活體共聚焦檢查；于1周、2周、4周取材經(jīng)4%多聚甲醛及3%戊二醛固定,分別進(jìn)行組織學(xué)檢查及掃描電鏡觀察。 [結(jié)果]1.構(gòu)建物移植組：術(shù)后1周,羊膜脫落,結(jié)膜輕度充血水腫,角膜上皮已覆蓋大部分植片,未見有角膜新生血管,虹膜紋理可見,組織學(xué)檢查見植片內(nèi)膠原排列規(guī)則整齊,有少量細(xì)胞分布,植片與植床邊界清晰,材料表面可見1～2層上皮細(xì)胞；術(shù)后2周,結(jié)膜輕度充血,中央角膜輕度混濁,未見有新生血管,植片表面有小部分區(qū)域上皮缺損,但可見虹膜紋理,組織學(xué)檢查見材料表面分布有類似正常角膜的上皮結(jié)構(gòu),植片內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整,膠原排列規(guī)則整齊,有細(xì)胞分布；術(shù)后4周,結(jié)膜充血水腫加重,植片表面不光滑,但較透明,可見角膜新生血管分布在周邊區(qū)域,上皮已覆蓋大部分植片,虹膜紋理可見,組織學(xué)檢查同術(shù)后2周,掃描電鏡示植片表面上皮排列與正常角膜已無明顯差異；術(shù)后5周(已拆線1周),結(jié)膜充血水腫消失,植片區(qū)域角膜較透明,有輕微瘢痕形成,大部分新生血管已退去,虹膜紋理清晰,植片區(qū)域可見點(diǎn)狀熒光素著色,激光共聚焦顯示術(shù)眼角膜內(nèi)皮密度及形態(tài)均正常。 2. APCM空支架組：術(shù)后4周內(nèi)角結(jié)膜反應(yīng)情況相似于構(gòu)建物移植組,但上皮始終無法完全覆蓋植片表面,中央角膜呈現(xiàn)中度混濁狀態(tài),但仍可透見虹膜。組織學(xué)檢查見植片膠原排列較規(guī)則,無明顯結(jié)構(gòu)改變,但與受體角膜分界明顯；植片表面可見有上皮細(xì)胞生長(zhǎng),但不同于正常上皮結(jié)構(gòu)；術(shù)后3周內(nèi),材料內(nèi)均無細(xì)胞分布,而在術(shù)后第4周材料內(nèi)部開始出現(xiàn)少許細(xì)胞。術(shù)后5周(未拆線)出現(xiàn)植片大量溶解現(xiàn)象,角結(jié)膜反應(yīng)較重。 [結(jié)論]體外構(gòu)建的兔角膜前板層可用于板層移植,具有一定的組織修復(fù)能力。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R779.65

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本文編號(hào)：2516774