【摘要】：目的1)誘導(dǎo)耳蝸非感覺(jué)上皮產(chǎn)生異位新生毛細(xì)胞；2)在個(gè)體細(xì)胞水平上對(duì)比新生的異位毛細(xì)胞與固有毛細(xì)胞的異同；3)觀察細(xì)胞間相互作用對(duì)新生感覺(jué)細(xì)胞細(xì)胞命運(yùn)的影響；4)從整個(gè)非感覺(jué)上皮區(qū)觀察異位新生感覺(jué)細(xì)胞群體的運(yùn)動(dòng)軌跡,與固有Corti器感覺(jué)上皮發(fā)育過(guò)程之間的共同點(diǎn),暨發(fā)育中匯聚伸展現(xiàn)象在體外再生過(guò)程中的重現(xiàn)；5)探索新生感覺(jué)細(xì)胞相互作用及群體匯聚遷移運(yùn)動(dòng)的可能因素。 方法本實(shí)驗(yàn)以新生大鼠為研究對(duì)象。應(yīng)用耳蝸基底膜體外培養(yǎng)技術(shù),體外構(gòu)建表達(dá)EGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記物或及表達(dá)math1基因的腺病毒載體(Ad-EGFP, Ad-EGFP-math1),感染基底膜,使被感染細(xì)胞過(guò)度表達(dá)math1基因,從而在非感覺(jué)上皮區(qū)產(chǎn)生異位新生毛細(xì)胞；應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)分析受感染細(xì)胞到新生毛細(xì)胞或新生支持細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)化,分析新感覺(jué)細(xì)胞個(gè)體及群體的遷移特點(diǎn)；利用掃描電子顯微鏡、熱場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡,觀察在誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中非感覺(jué)上皮區(qū)細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變、尤其是纖毛的再生過(guò)程,毗鄰細(xì)胞之間的相互作用,以及整個(gè)上皮細(xì)胞區(qū)的移動(dòng)；采用半透膜共培養(yǎng)體系以及同皿共培養(yǎng)體系,觀察耳蝸不同部位組織之間的相互作用,初步探討再生感覺(jué)細(xì)胞上皮群體移動(dòng)的信號(hào)的來(lái)源和傳遞方式,及其從耳蝸底圈到頂圈的運(yùn)動(dòng)差異；以倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)中的組織及其熒光標(biāo)記,以正置熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡采集組織鋪片的抗體熒光標(biāo)記；以活細(xì)胞熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)組織中細(xì)胞的群體移動(dòng)。 結(jié)果1)體外培養(yǎng)的耳蝸基底膜的非感覺(jué)上皮細(xì)胞,包括Corti器內(nèi)側(cè)的大上皮嵴區(qū)(Greater epithelial region, GER)和Corti器外側(cè)體外增殖的非感覺(jué)細(xì)胞區(qū)(lateral non-sensory region, LNSR),過(guò)表達(dá)math1基因均可以產(chǎn)生異位新生的毛細(xì)胞,但GER區(qū)與LNSR區(qū)在感染編碼math1的腺病毒后產(chǎn)生新生毛細(xì)胞的過(guò)程不盡相同；2)這些新生毛細(xì)胞與固有毛細(xì)胞高度相似,共同特點(diǎn)有：細(xì)胞呈圓形或梨形的立體形態(tài),毛細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志物myosinⅦa陽(yáng)性,具有表皮板,有形態(tài)近似成熟的靜纖毛束,能形成長(zhǎng)而粗大的動(dòng)纖毛；3)靜纖毛束的產(chǎn)生過(guò)程,是單根纖毛從延長(zhǎng)的細(xì)胞表面微絨毛形態(tài),到具有纖細(xì)堅(jiān)韌的根部、直立的體部和紡錘尖的頂部形態(tài)的靜纖毛,從倒伏彎曲到束狀直立在毛細(xì)胞頂部,并形成有梯度排列的靜纖毛束,期間伴隨著靜纖毛間的側(cè)連接由無(wú)到有,再由多到少的過(guò)程。梯度排列的靜纖毛之間可見(jiàn)頂連接。有的新生毛細(xì)胞可見(jiàn)動(dòng)纖毛；4)部分感染編碼math1基因腺病毒的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為新的支持細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)由扁平變?yōu)榱Ⅲw,呈杯狀或滲出指狀突起,包繞鄰近新生毛細(xì)胞；毛細(xì)胞標(biāo)記物myosin7a呈陰性,而支持細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP呈陽(yáng)性。同時(shí)新生的支持細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)移到在結(jié)構(gòu)上與其密切相關(guān)的新生毛細(xì)胞的下層,正如固有的毛細(xì)胞和支持細(xì)胞一樣,被感染的上皮趨向于形成上下兩層細(xì)胞的聽(tīng)覺(jué)感覺(jué)上皮結(jié)構(gòu),將其合稱(chēng)為新生毛細(xì)胞-支持細(xì)胞單位；5)新生的感覺(jué)細(xì)胞能夠運(yùn)動(dòng)和遷移,整合入Corti器固有毛細(xì)胞中。GER的新生毛細(xì)胞以個(gè)體細(xì)胞的方式插入Corti器；而LNSR的新生毛細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞群體從最外側(cè)向內(nèi)側(cè)蝸軸方向變窄、遷移,最終集體整合入Corti器的外毛細(xì)胞,固有外毛細(xì)胞也在被插入的過(guò)程中受到影響而重新排列,這一過(guò)程與發(fā)育中感覺(jué)上皮的平面細(xì)胞極性匯聚伸展的特點(diǎn)高度相似；6)LNSR新生感覺(jué)上皮的遷移過(guò)程,在同樣的時(shí)間,靠近耳蝸基底端的比靠近蝸尖的組織變窄更快,且更早的整合入Corti器。在共培養(yǎng)條件下,靠近基底段的組織,能夠吸引基底段和蝸尖段產(chǎn)生的LNSR新生感覺(jué)上皮,一致向基底段的Corti器遷移,而遠(yuǎn)離蝸尖段的Corti器。7)與內(nèi)側(cè)的Corti器有連接的LNSR新生感覺(jué)上皮,能夠產(chǎn)生向內(nèi)的匯聚運(yùn)動(dòng)和向Corti器的整合,而與內(nèi)側(cè)的Corti器無(wú)細(xì)胞連接的LNSR感染的上皮,可以產(chǎn)生新的毛細(xì)胞,但是不能發(fā)生任何群體遷移及變窄的過(guò)程。 結(jié)論1)GER和LNSR的非感覺(jué)上皮細(xì)胞均可作為新生毛細(xì)胞的來(lái)源。2)新生毛細(xì)胞的靜纖毛有序排列,依賴(lài)于靜纖毛間側(cè)連接的機(jī)械牽拉和動(dòng)態(tài)重塑。3)受感染過(guò)表達(dá)math1的細(xì)胞一部分轉(zhuǎn)變?yōu)樾旅?xì)胞,一部分轉(zhuǎn)變?yōu)樾轮С旨?xì)胞,這與發(fā)育過(guò)程支持細(xì)胞和毛細(xì)胞具共同的表達(dá)math1的前體細(xì)胞相似；4)細(xì)胞最終分化命運(yùn)的選擇,與相鄰細(xì)胞間的相互作用有關(guān),可能與math1的表達(dá)先后及表達(dá)量多少有關(guān)。5)新生的感覺(jué)細(xì)胞群體能夠向內(nèi)遷移,整合到Corti器內(nèi)固有的毛細(xì)胞,這正是毛細(xì)胞再生研究的目標(biāo)之一,是對(duì)毛細(xì)胞再生的治療的一大鼓舞。而在整合過(guò)程中,LNSR能夠重現(xiàn)具有發(fā)育過(guò)程中感覺(jué)上皮的平面細(xì)胞極性匯聚伸展的特點(diǎn),其遷移過(guò)程的誘導(dǎo)信號(hào)來(lái)源于內(nèi)側(cè)的固有Corti器。而這個(gè)誘導(dǎo)信號(hào)需要通過(guò)細(xì)胞間連接的存在,即從細(xì)胞到細(xì)胞傳遞,而這同時(shí)提示我們,在內(nèi)耳干細(xì)胞移植的研究中,移植入內(nèi)耳的干細(xì)胞漂浮在內(nèi)淋巴液不能與Corti器產(chǎn)生細(xì)胞連接,可能是干細(xì)胞移植成功率不高的原因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R764

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2457146