【摘要】：聽(tīng)力障礙是影響公眾身體健康和生活質(zhì)量的重要因素,數(shù)以億計(jì)的人受到威脅。世界衛(wèi)生組織2013年2月27日在日內(nèi)瓦表示,全世界有3.6億人患有耳聾或聽(tīng)力障礙,占全球人口的5%,其中三分之二在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)是世界上最大的發(fā)展中國(guó)家,有13億人口,聽(tīng)力障礙殘疾人有2057萬(wàn),占全國(guó)人口的16.79%o,絕大部分為感音神經(jīng)性聾。 感音神經(jīng)性聾的病理改變主要是毛細(xì)胞損傷、螺旋神經(jīng)節(jié)、支持細(xì)胞及神經(jīng)末梢的器質(zhì)性改變,發(fā)病原因公認(rèn)有缺血、病毒感染、耳毒性藥物中毒及老年性退行性變等,尤其缺血因素最為常見(jiàn)。而血流障礙中只有少數(shù)為單純的缺血損傷,大部分是缺血后的再灌注損傷。例如突發(fā)性耳聾,目前多認(rèn)為是內(nèi)耳微循環(huán)障礙所致的感音神經(jīng)性聾。有研究指出缺血后再灌注造成的損傷大于單純?nèi)毖斐傻膿p傷。所以探討內(nèi)耳缺血／再灌注損傷(I/RI)的機(jī)制將非常有利于內(nèi)耳疾病的研究。 鹽酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride,簡(jiǎn)稱椒苯酮胺,PPTA)是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所合成篩選出的化學(xué)創(chuàng)新藥。相關(guān)研究表明椒苯酮胺對(duì)缺血再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用,是鈣增敏劑類強(qiáng)心藥及心肌保護(hù)劑。另外有研究表明其對(duì)缺血再灌注損傷腦組織也有保護(hù)作用,但國(guó)內(nèi)外尚無(wú)椒苯酮胺抗內(nèi)耳缺血再灌注損傷作用的研究。本實(shí)驗(yàn)從聽(tīng)覺(jué)功能、細(xì)胞形態(tài)、炎性因子及細(xì)胞凋亡四個(gè)方面對(duì)豚鼠耳蝸的(I/RI)進(jìn)行研究,旨在探討椒苯酮胺對(duì)內(nèi)耳(I/RI)的保護(hù)作用及可能機(jī)制,為椒苯酮胺用于缺血性內(nèi)耳疾病的治療提供藥理學(xué)依據(jù)。本研究分為四個(gè)部分： 第一部分耳蝸缺血/再灌注(I/R)豚鼠模型的建立 目的 建立豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷模型,探討豚鼠耳蝸缺血/再灌注損傷后聽(tīng)功能改變。 方法 將24只健康、耳廓反射靈敏,體重200-250g豚鼠隨機(jī)分成3組,分別為正常組、空白對(duì)照組、缺血再灌注組。缺血再灌注模型通過(guò)暫時(shí)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)椎動(dòng)脈、結(jié)扎線活結(jié)結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈,實(shí)驗(yàn)中激光多普勒檢測(cè)耳蝸血流(CoBF)。各組動(dòng)物分別于手術(shù)前、缺血再灌注6h、24h、48h行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)測(cè)定,觀察ABR各波潛伏期、Ⅰ—Ⅲ波間期和Ⅲ波閾值。 結(jié)果 正常組、假手術(shù)組術(shù)前、術(shù)后ABR閾值無(wú)顯著變化;缺血再灌注組再灌注6小時(shí)、24小時(shí)后ABR閩值顯著升高(P0.05),24小時(shí)達(dá)到高峰,48小時(shí)ABR閾值有所恢復(fù),但未恢復(fù)正常。 結(jié)論 通過(guò)暫時(shí)性微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)椎動(dòng)脈及右側(cè)頸總動(dòng)脈,夾閉1小時(shí)制造缺血模型,松開(kāi)三條動(dòng)脈制造再灌注模型�？芍露亾p傷,表現(xiàn)為聽(tīng)功能下降,在再灌注后6h、24h、48h,以24h聽(tīng)閾最高,即耳蝸損傷最為嚴(yán)重。 第二部分PPTA對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的聽(tīng)力保護(hù)作用及耳蝸組織掃描電鏡和透射電鏡觀察 目的 探討鹽酸椒苯酮胺(PPTA)對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后聽(tīng)功能及耳蝸形態(tài)的影響。 方法 采用前述的缺血再灌注模型,將32只豚鼠隨機(jī)分為4組,每組8只,每組4只用于掃描電鏡觀察,剩余4只用于透射電鏡觀察。分為正常組,假手術(shù)組,缺血再灌注對(duì)照組,缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺,缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射。測(cè)量實(shí)驗(yàn)前后各組的聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)波Ⅲ反應(yīng)閾的變化。24小時(shí)迅速斷頭取聽(tīng)泡,,在掃描電鏡、透射電鏡下觀察耳蝸結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 1、正常組、假手術(shù)組實(shí)驗(yàn)前后ABR波Ⅲ反應(yīng)閾值無(wú)顯著變化(P0.05),缺血再灌注對(duì)照組,造模成功后ABR波Ⅲ顯著升高(P0.05),缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組,造模成功后ABR波Ⅲ升高,但低于缺血再灌注對(duì)照組(P0.05)。 2、掃描電鏡下觀察耳蝸組織的形態(tài)學(xué)變化：正常組及空白對(duì)照組豚鼠耳蝸基底膜居外側(cè)3排外毛細(xì)胞,1排內(nèi)毛細(xì)胞呈刷狀,排列整齊,內(nèi)、外毛細(xì)胞纖毛排列整齊,無(wú)缺失、倒伏。缺血再灌注對(duì)照組外毛細(xì)胞腫脹、缺失,纖毛排列紊亂、倒伏,部分缺失。缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組少量外毛細(xì)胞有纖毛倒伏。 3、透射電鏡下觀察：正常組及空白對(duì)照組耳蝸毛細(xì)胞細(xì)胞核圓、核染色質(zhì)分布均勻,線粒體形態(tài)正常,分布均勻,毛細(xì)胞突觸結(jié)構(gòu)清晰。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元未見(jiàn)明顯脫髓鞘改變,血管紋內(nèi)皮細(xì)胞核呈梭形；IR組耳蝸毛細(xì)胞核邊界不清,可見(jiàn)固縮、邊集現(xiàn)象,突觸結(jié)構(gòu)消失。螺旋神經(jīng)節(jié)可見(jiàn)大量脫髓鞘改變。血管紋內(nèi)皮細(xì)胞核可見(jiàn)固縮、邊集現(xiàn)象,呈現(xiàn)充血改變；缺血再灌注+鹽酸椒苯酮胺組毛細(xì)胞核邊界清楚,核染色質(zhì)分布均勻,線粒體形態(tài)分布均勻,無(wú)明顯腫脹,突觸結(jié)構(gòu)尚清晰。螺旋神經(jīng)節(jié)可見(jiàn)少量脫髓鞘變。血管紋內(nèi)皮細(xì)胞核膜完整,無(wú)固縮、邊集現(xiàn)象。 結(jié)論 PPTA對(duì)豚鼠耳蝸的缺血再灌注聽(tīng)力損傷有保護(hù)作用,并且可以防止耳蝸缺血再灌注損傷后毛細(xì)胞的損傷缺失。 第三部分鹽酸椒苯酮胺對(duì)缺血再灌注后IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)的影響 目的 1.探討耳蝸炎性反應(yīng)與缺血再灌注損傷的關(guān)系。 2.探討缺血再灌注后豚鼠耳蝸IL-1β和TNF-α的mRNA的表達(dá)與炎性反應(yīng)的關(guān)系。 3.探討PPTA對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。 方法 采用前述的缺血再灌注模型,將24只豚鼠隨機(jī)分為4組,每組6只,分別為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注對(duì)照組和缺血再灌注PPTA組。缺血再灌注PPTA組于缺血1小時(shí)再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射鹽酸椒苯酮胺(10mg/kg),缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射,24小時(shí)后取標(biāo)本。用RT-PCR法檢測(cè)IL-1β和TNF-α的mRNA的表達(dá)。用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,若滿足方差齊性,用LSD檢驗(yàn)比較組間差異,若不滿足方差齊性,用Dunnett'sT3比較組間差異,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 缺血再灌注對(duì)照組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量顯著高于正常組和假手術(shù)組(P0.001)；缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量顯著低于缺血再灌注對(duì)照組(P0.001)；缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織IL-1βmRNA表達(dá)量與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0560.05)。 缺血再灌注對(duì)照組耳蝸組織TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組和假手術(shù)組(P0.001)；缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織TNF-α mRNA表達(dá)量顯著低于缺血再灌注對(duì)照組(P0.001)；缺血再灌注PPTA保護(hù)組耳蝸組織TNF-α mRNA表達(dá)量高于正常組(P=0.0090.05)。 結(jié)論 1. PPTA具有拮抗耳蝸組織缺血再灌注損傷作用 2. PPTA可能通過(guò)抑制炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)耳蝸缺血再灌注損傷的拮抗作用 第四部分PPTA對(duì)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡和Fas蛋白、caspase-1的mRNA表達(dá)的影響 目的： 1.觀察缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸細(xì)胞凋亡的情況。 2.對(duì)缺血再灌注損傷后豚鼠耳蝸Fas蛋白、caspase-1的mRNA的表達(dá)與細(xì)胞凋亡間的關(guān)系進(jìn)行分析。 3.探討PPTA對(duì)豚鼠缺血再灌注損傷后凋亡細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法： 采用前述的缺血再灌注模型,將48只豚鼠隨機(jī)分為4組,每組12只,分別為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注組對(duì)照組、缺血再灌注PPTA組(缺血60min行再灌注后立即經(jīng)股靜脈注射10mg/kg鹽酸椒苯酮胺),缺血再灌注對(duì)照組以等量生理鹽水代替椒苯酮胺注射,24小時(shí)后取標(biāo)本。用免疫組織化學(xué)法(SP)觀察Fas蛋白的表達(dá)和分布,并用Motic圖象分析系統(tǒng)分析單位面積下陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)；用TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡的情況；用RT-PCR法檢測(cè)caspase-1的mRNA的表達(dá),并比較PPTA干預(yù)前后的變化。運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,用LSD檢驗(yàn)比較組間差異,P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 免疫組織化學(xué)染色見(jiàn)正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組耳蝸血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器Fas表達(dá)為弱陽(yáng)性,缺血再灌注組表達(dá)顯著增強(qiáng)。IOD值顯示正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注PPTA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),缺血再灌注組較其他三組顯著增強(qiáng)(P0.05)。 TUNEL法顯示正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組耳蝸各部位沒(méi)有或僅有個(gè)別部位出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,缺血及再灌注對(duì)照組耳蝸凋亡細(xì)胞明顯增多,PPTA干預(yù)后凋亡細(xì)胞顯著減少。 缺血再灌注組耳蝸組織Caspase-1mRNA表達(dá)量顯著高于正常組、假手術(shù)組和缺血再灌注PPTA組(P0.001)；缺血再灌注PPTA組耳蝸組織Caspase-1mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P0.001)；正常組和假手術(shù)組耳蝸組織Caspase-1mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.825)。 結(jié)論： 通過(guò)豚鼠耳蝸缺血再灌注損傷模型PPTA及對(duì)照試驗(yàn)。正常組豚鼠耳蝸各部位Fas為弱陽(yáng)性表達(dá),無(wú)或罕有凋亡細(xì)胞。缺血再灌注組Fas表達(dá)增強(qiáng),凋亡細(xì)胞增多,進(jìn)行干預(yù)后使凋亡細(xì)胞顯著減少。缺血再灌注耳蝸組織Caspase-1mRNA的表達(dá)顯著增高,PPTA可部分但有效地降低Caspase-1mRNA的表達(dá)。提示細(xì)胞凋亡是耳蝸缺血再灌組損傷的一種細(xì)胞損傷形式,PPTA可能通過(guò)抑制Fas蛋白及Caspase-1mRNA的表達(dá),通過(guò)減少細(xì)胞凋亡而對(duì)缺血再灌注損傷后的耳蝸起保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R764

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本文編號(hào)：2439731