【摘要】：前言 青光眼視神經(jīng)病變是全球首位不可逆致盲眼病。主要表現(xiàn)為以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell, RGCs)進(jìn)行性丟失為病理基礎(chǔ)的特征性視神經(jīng)損害和視野缺損。目前認(rèn)為高眼壓是主要的危險(xiǎn)因素和始動(dòng)因素。然而,單純降低眼壓只能從一定程度上緩解病情的發(fā)展卻不能遏制繼發(fā)性RGCs死亡及其軸突的潰變。從而使得臨床上有效控制視神經(jīng)病變發(fā)展的手段有限。 青光眼和線粒體視神經(jīng)病變在病理特征和臨床表現(xiàn)上的諸多相似性使線粒體在青光眼視神經(jīng)病變中的作用受到越來越多的重視和關(guān)注。此外,現(xiàn)已證實(shí)線粒體功能障礙在阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)變性疾病中起了重要作用。青光眼也屬于神經(jīng)變性類疾病,具有這些疾病的共同特點(diǎn)：年齡相關(guān)性、神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性丟失。這些證據(jù)都提示線粒體在青光眼發(fā)展中扮演重要角色的可能性。那么：線粒體在RGCs進(jìn)行性死亡過程中發(fā)生了哪些改變?是否可以解釋臨床上一些患者在眼壓有效控制以后,視力損害仍然持續(xù)加重的現(xiàn)象?這些問題尚未見報(bào)道。 線粒體被稱為細(xì)胞內(nèi)的能量工廠,對于細(xì)胞的存活和死亡起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。線粒體DNA(mtDNA)是核外唯一的遺傳物質(zhì),因其特殊的組成結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)定位使mtDNA較nDNA易受損傷、突變率高。同時(shí),mtDNA幾乎不存在非編碼區(qū),任何位點(diǎn)的突變都可能被轉(zhuǎn)錄,造成蛋白質(zhì)表達(dá)改變,產(chǎn)生嚴(yán)重后果。 RGCs作為一類代謝旺盛的神經(jīng)元,包體和軸突中線粒體的含量非常高。這也就決定了RGC對線粒體功能異常的敏感性。最近有學(xué)者在青光眼患者外周血中發(fā)現(xiàn)mtDNA突變增加和ATP合成障礙,提示mtDNA損傷及線粒體功能下降是青光眼發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。然而,這些研究僅局限于患者外周血,還無法解釋青光眼視神經(jīng)病變過程中RGCs和視神經(jīng)進(jìn)行性損傷,甚至在眼壓有效控制后視力損害仍持續(xù)加重的原因。關(guān)于青光眼視神經(jīng)病變發(fā)展過程中,RGCs mtDNA的突變、可能的突變機(jī)制、以及mtDNA突變在細(xì)胞進(jìn)行性死亡中的作用等問題,未見報(bào)道。 為此,本研究以慢性高眼壓Wistar大鼠模型為對象,研究了mtDNA、mtDNA修復(fù)酶、線粒體復(fù)合物功能在高眼壓和眼壓恢復(fù)正常后的變化,并通過體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探討了高眼壓mtDNA突變的可能機(jī)制及mtDNA突變與線粒體功能障礙的關(guān)系。此外,還深入探討了mtDNA突變或損傷引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行性死亡的可能機(jī)制。 第一部分慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞mtDNA及線粒體功能變化目的：以大鼠慢性高眼壓大鼠模型為研究對象,系統(tǒng)研究在高眼壓期間和眼壓恢復(fù)正常后RGCs的丟失特征,以及RGCs中mtDNA損傷與突變、mtDNA修復(fù)能力、線粒體功能的動(dòng)態(tài)變化。初步揭示mtDNA異常在青光眼RGCs死亡中的重要性。方法：選用8周齡Wistar大鼠,通過鞏膜上靜脈燒灼(EVC)方法建立慢性高眼壓模型。熒光金逆行標(biāo)記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片觀察、計(jì)數(shù)RGCs的存活數(shù)量。SMI32免疫熒光標(biāo)記視神經(jīng)觀察其丟失情況。采用免疫吸附的方法分離純化RGCs后抽提線粒體、mtDNA.nDNA.線粒體蛋白、細(xì)胞漿蛋白、總mRNA.以long-extensionPCR方法檢測mtDNA損傷、DNA隨即突變捕獲的方法檢測mtDNA突變率.western blot他realtime PCR方法檢測mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG的表達(dá)、生化方法檢測線粒體功能,包括線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率和ROS含量。結(jié)果：80%術(shù)眼在EVC術(shù)后1天時(shí)眼壓升高,平均值為25.3±1.6mmHg,在這些眼中高眼壓能持續(xù)至6周者約占35%(18.7±1.1mmHg).術(shù)后6-7周因血管再通導(dǎo)致眼壓逐步降至正常,直至6個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對側(cè)假手術(shù)眼眼壓穩(wěn)定維持在12.16±0.89mmHg。RGCs計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)不僅在高眼壓期間其數(shù)量持續(xù)減少,眼壓恢復(fù)正常后仍進(jìn)行性下降,術(shù)后2、4、6個(gè)月RGCs丟失的比例依次為24.6±0.17%(p0.05)、30.4±0.78%(p0.01)和34.8±0.15%(p0.01)。SMI32陽性染色定量分析也證實(shí)軸突在眼壓恢復(fù)正常后的6周至6月期間繼續(xù)丟失了12%。EVC術(shù)后2周檢測到mtDNA損傷,并不斷增加,但在高眼壓期間與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。眼壓恢復(fù)正常后繼續(xù)呈進(jìn)行性加重趨勢,于2、4、6個(gè)月時(shí)檢測mtDNA損傷分別是對照組的1.5倍(p0.05)、2.8倍(p0.01)和3.4倍(p0.01)。mtDNA突變隨機(jī)捕獲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果：眼壓增高后2-4周可檢測到mtDNA突變增多,眼壓恢復(fù)正常后,突變未見減少反而繼續(xù)增加,術(shù)后2、4、6個(gè)月Taql1427位點(diǎn)的突變率分別是對照組的7.6倍(p0.05)、10.3倍(p0.01)和16.8倍(p0.01)；Taql8335位點(diǎn)mtDNA突變率在術(shù)后6周和6月分別是對照組的9.9倍(p0.01)和12.7倍(p0.01)。高眼壓后RGCs的mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG在線粒體內(nèi)表達(dá)下降,即使眼壓恢復(fù)正常仍未見緩解。而mRNA表達(dá)卻表現(xiàn)出與蛋白表達(dá)的不一致,眼壓升高后迅速增多,隨后逐漸下降,但OGG1和MYH始終未降至正常水平以下。高眼壓后RGCs中線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性與對照組相比下降,其中復(fù)合物Ⅰ在6周、2、4、6月時(shí)下降36%,(p0.05)、39%(p0.05)、41%(p0.05)和43%(p0.05)；復(fù)合物Ⅲ下降更明顯,第2周下降35%(p0.05),4月和6月時(shí)分別下降了56%(p0.01)和62%(p0.01)。術(shù)后6月時(shí)復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ中由mtDNA編碼的亞基cyt B和ND5的蛋白含量仍顯著減少。RGCs內(nèi)線粒體ATP生成率在眼壓升高后出現(xiàn)一過性增高,是對照組的5.2倍(p0.01),隨即下降,眼壓恢復(fù)正常后仍未改善,至6個(gè)月實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)下降了48%,差異出現(xiàn)顯著性(p0.05),表現(xiàn)為不可逆性減少。ROS在眼壓升高后1周迅速升高,1周時(shí)達(dá)到峰值(為對照組1.6倍,p0.05)。隨后ROS含量快速下降直至正常。術(shù)后4個(gè)月和6個(gè)月時(shí)檢測到ROS含量再次升高。結(jié)論：高眼壓持續(xù)6周后,即使眼壓恢復(fù)正常,RGCs及其軸突仍呈進(jìn)行性丟失；高眼壓后,RGCs線粒體DNA損傷和突變增加,且在眼壓恢復(fù)正常后仍進(jìn)行性、累積性加重,伴隨mtDNA修復(fù)能力持續(xù)低下和線粒體功能不可逆性障礙。 第二部分壓力對線粒體DNA損傷及功能影響的體外研究目的：明確壓力是否可以引起mtDNA的損傷和突變,探討mtDNA突變和損傷與線粒體功能障礙的關(guān)系。方法：為在體外模擬慢性高眼壓狀態(tài),本實(shí)驗(yàn)采用加壓培養(yǎng)大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞,壓力設(shè)定為30mmHg。于加壓后12、24、48、72、96和120小時(shí)收集細(xì)胞,利用long-extension PCR口隨機(jī)突變捕獲實(shí)驗(yàn)檢測mtDNA的損傷和突變。Real-time PCR和westeren blot方法測定mtDNA修復(fù)酶OGG1、MYH和POLG的表達(dá)。DCF-DA方法檢測ROS含量。Lent i-shPOLG轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)mtDNA損傷和突變的細(xì)胞模型,western blot檢測由mtDNA編碼的線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的亞基ND4、ND5.ND6和cyt B的蛋白含量。進(jìn)而采用生化方法檢測復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性、ATP生成率,JC-1熒光探針測定線粒體膜電位的變化。結(jié)果：加壓24小時(shí)即可檢測到mtDNA損傷增加,72小時(shí)較對照組增加40%(p0.05)。加壓48小時(shí)后Taq11427位點(diǎn)突變增加,是對照組的2.2倍(p0.05),120小時(shí)達(dá)到5.1倍(p0.001)。Taq18335位點(diǎn)突變增加趨勢與Taq11427一致,120小時(shí)達(dá)到對照組的4.9倍(p0.001)。加壓后細(xì)胞ROS含量未見顯著改變。OGG1、MYH和POLG的mRNA表達(dá)在加壓后迅速升高,12小時(shí)達(dá)到峰值,分別是對照組的11.2倍(p0.01)、6.3倍(p0.05)和1.8倍(p0.05)。隨后OGG1、MYH逐漸恢復(fù)正常直至120小時(shí),而POLG則持續(xù)下降至正常水平以下。線粒體內(nèi)OGG1、MYH和POLG蛋白表達(dá)在加壓后48小時(shí)開始下降,于72小時(shí)和120小時(shí)分別下降了56%(p0.05)、60%(p0.01)；38%(p0.05)、63%(p0.01)和39%(p0.05)、37%(p0.05)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染Lenti-shPOLG后5天和10天,mtDNA損傷較對照組分別增加了16%(p0.05)和46%(p0.01).mtDNA編碼的線粒體復(fù)合物亞基ND5、ND6和cyt B的蛋白表達(dá)顯著下降,與對照組相比分別下降43%(p0.05)、32%(p0.05)和34%(p0.05)。復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性在轉(zhuǎn)染后10天時(shí)分別下降22.6%(p0.05)和40.8%(p0.05),線粒體膜電位下降了63%(p0.001)。轉(zhuǎn)染后第9天ATP生成率是對照組的67.9%(p0.05),顯著減少。 結(jié)論：異常升高的壓力可以直接導(dǎo)致mtDNA損傷和突變,一方面直接導(dǎo)致了線粒體功能障礙；另一方面,mtDNA損傷和突變又可造成線粒體膜電位下降,從而引起mtDNA修復(fù)酶表達(dá)下降,三者可形成惡性循環(huán),最終使mtDNA損傷和突變進(jìn)行性、累積性加重。 第三部分mtDNA損傷和突變加重視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的易損性 目的：通過建立RGCs mtDNA損傷和突變的動(dòng)物模型,研究mtDNA損傷和突變增多后RGCs的凋亡情況,以及對青光眼常見損傷因素如眼壓升高和谷氨酸濃度增加的敏感性。 方法：設(shè)計(jì)三條shPOLG模版DNA,以pSilencer1.0-U6為載體構(gòu)建shPOLG和對照質(zhì)粒,real-time PCR和westernblot方法檢測POLG的表達(dá),篩選出抑制效率最佳的質(zhì)粒并將其克隆到pAAV-CMV-GFP載體中,構(gòu)建AAV2-shPOLG載體、擴(kuò)增、純化。Wistar大鼠玻璃體腔注射AAV2-shPOLG建立RGCs mtDNA損傷和突變模型。注射后2、6、12個(gè)月western blot檢測RGCs中POLG蛋白表達(dá)、LX-PCR和mt突變隨機(jī)捕獲實(shí)驗(yàn)檢測mtDNA損傷和突變,DCF-DA法檢測ROS含量,明確建模是否成功。取注射后12個(gè)月的大鼠視網(wǎng)膜下注射谷氨酸或行鞏膜上靜脈燒灼手術(shù)(EVC),1周后處死大鼠,進(jìn)行視網(wǎng)膜TUNEL原位檢測,Di工逆行標(biāo)記RGCs后視網(wǎng)膜鋪片計(jì)數(shù)存活RGCs數(shù)量。Western blot檢測RGCs中裂解的caspase-3的含量,以明確RGCs的死亡是否屬于凋亡。 結(jié)果：AAV2-shPOLG玻璃體腔注射后2、6、12個(gè)月,mtDNA損傷較對照組增加21%、31%(p0.01)和63%(p0.01),Taql1427位點(diǎn)突變率分別是對照組的6.5倍(p0.001)、9.3倍(p0.001)和17.1倍(p0.001)。RGCs中ROS含量未見顯著改變。TUNEL結(jié)果顯示：rAAV2-shPOLG組中RGCs凋亡數(shù)量是對照組的2.3倍(p0.05)；rAAV2-shPOLG聯(lián)合EVC組和rAAV2-shPOLG聯(lián)合谷氨酸組中RGCs凋亡數(shù)量分別較相應(yīng)的對照組增加了21%(p0.05)和35%(p0.01)。裂解的caspase-3含量在rAAV2-shPOLG.rAAV2-shPOLG聯(lián)合EVC和rAAV2-shPOLG聯(lián)合谷氨酸組中分別增高了43%(p0.05)、41%(p0.05)和48%(p0.05)。 結(jié)論：線粒體DNA損傷和突變可以不依賴壓力直接引起活體內(nèi)RGCs凋亡；也使RGCs在受到眼壓、谷氨酸損傷后的凋亡數(shù)量增加。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R775.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2427482