【摘要】： 背景:鼻咽癌是中國(guó)南方最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,雖然鼻咽癌對(duì)放射治療和化療都比較敏感,但是其5年生存率一直在65%左右。所以尋找一種新的治療方法來(lái)提高臨床療效就非常有必要。光動(dòng)力治療是現(xiàn)代腫瘤治療中的一種新方法,其原理是利用惡性腫瘤能選擇性地?cái)z入并潴留光敏劑,在特定波長(zhǎng)的光的激發(fā)下,引起一系列光化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的不可逆損傷達(dá)到治癌目的。最近的研究表明:Caspase-3在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起到關(guān)鍵的作用,但是Caspase-3是一種效應(yīng)的Caspase,它由于缺乏長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域而處于失活狀態(tài),它的激活需要啟動(dòng)的Caspase的蛋白水解作用。一旦激活,他們就破壞細(xì)胞的調(diào)節(jié)平衡,導(dǎo)致可以觀測(cè)的細(xì)胞凋亡。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染效率較低,細(xì)胞毒性較大,光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染(PGT)是一種新的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法。光化學(xué)基因轉(zhuǎn)染是一種新的基因轉(zhuǎn)染工具,它被光誘導(dǎo)而能夠把基因轉(zhuǎn)染到固定的靶區(qū)域,從而提高轉(zhuǎn)染水平。本研究合成了攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體,其表現(xiàn)出高效的光敏作用。另外本研究成功地構(gòu)建了能自發(fā)激活的Rev-caspase-3,將納米光敏劑作為轉(zhuǎn)染載體將質(zhì)粒帶入鼻咽癌細(xì)胞內(nèi),利用光化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù),提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后的Rev-caspase-3自發(fā)激活表達(dá)活性Caspase-3,啟動(dòng)凋亡程序而殺滅腫瘤細(xì)胞,從而探索一條治療鼻咽癌的新途徑。 第一部分?jǐn)y竹紅菌乙素陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體的制備 目的:制備攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體并對(duì)其進(jìn)行表征。 方法:薄膜分散-超聲乳化法制備攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體,利用高效液相法檢測(cè)脂質(zhì)體的包封率,MALVERN ZETASIZER 3000HS激光散射粒度分析儀檢測(cè)質(zhì)粒的粒徑和電壓。本實(shí)驗(yàn)將脂質(zhì)體分別在4℃、25℃下閉光放置7天,考察不同條件下脂質(zhì)體中竹紅菌乙素濃度隨存放時(shí)間的變化趨勢(shì)。 結(jié)果:利用薄膜分散-超聲乳化法制備了攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體,納米光敏劑的包封率達(dá)85.8±4.5 %,其帶有正電荷,電壓為:21.1mv,其粒徑范圍為400-700nm,平均粒徑為532nm。脂質(zhì)體于4℃貯存時(shí),濃度、粒徑及電荷無(wú)顯著變化。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功地制備了攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體。高效液相檢測(cè),納米脂質(zhì)體的包封率達(dá)85.8±4.5%。納米脂質(zhì)體比較穩(wěn)定,適合實(shí)驗(yàn)室使用。 第二部分LED光源激發(fā)納米光敏劑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的影響及機(jī)制研究 目的:探討LED光源激發(fā)納米光敏劑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其機(jī)制。 方法:用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)納米光敏劑在NPC/CNE-2細(xì)胞中的最佳吸收時(shí)間,作為下一步光動(dòng)力治療光敏劑孵育時(shí)間的依據(jù)。采用MTT比色法觀察LED活化納米光敏劑對(duì)NPC/CNE-2細(xì)胞的增殖影響情況。PI染色和Hoechst33258染色檢測(cè)LED活化納米光敏劑的光動(dòng)力療法致NPC/CNE-2細(xì)胞凋亡中的作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性Caspase-3的表達(dá)了解光動(dòng)力療法中細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 結(jié)果:熒光分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果表明,納米光敏劑在NPC/CNE-2細(xì)胞內(nèi)的最佳吸收時(shí)間為6小時(shí)。LED活化納米光敏劑可以明顯的抑制NPC/CNE-2細(xì)胞的增殖。在光敏劑濃度為10μM及LED能量密度為1J/cm2時(shí),可以得到IC50,并且光動(dòng)力作用18h后可以檢測(cè)到明顯的Sub-G1峰,凋亡指數(shù)為34.32±1.92%,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)至30h,凋亡指數(shù)增加至44.91±2.03%。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)活性Caspase-3的表達(dá)率為43.90%。 結(jié)論:納米光敏劑能被NPC/CNE-2細(xì)胞所吸收,其最佳的吸收時(shí)間為6小時(shí)。納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療能有效地殺滅鼻咽癌細(xì)胞,其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能是激活了線粒體途徑中的Caspase-3,引起細(xì)胞凋亡的不可逆的發(fā)生。 第三部分:納米光敏劑轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3及光動(dòng)力療法對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖影響及凋亡機(jī)制的研究 目的:了解納米光敏劑轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3及納米光敏劑介導(dǎo)PDT對(duì)NPC/CNE-2細(xì)胞凋亡影響及其機(jī)制 方法:感受態(tài)擴(kuò)增質(zhì)粒,DNA雙酶切鑒定質(zhì)粒,凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)檢測(cè)納米光敏劑和質(zhì)粒的結(jié)合能力。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)納米光敏劑轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。MTT比色法檢測(cè)納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力作用和Rev-caspase-3轉(zhuǎn)染后的共同作用對(duì)NPC/CNE-2細(xì)胞增殖的影響。PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)光動(dòng)力作用及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果:擴(kuò)增的質(zhì)粒經(jīng)DNA雙酶切切為2個(gè)條帶,分別代表空載體和Rev-caspase-3序列。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明:納米光敏劑與質(zhì)粒的質(zhì)量比越高,其結(jié)合質(zhì)粒的能力越強(qiáng)。納米光敏劑可以將Rev-caspase-3轉(zhuǎn)染進(jìn)入NPC/CNE-2細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染24h后的表達(dá)率為63.10%。細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)表明:轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3和納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療共同作用后細(xì)胞存活率較這兩者單獨(dú)作用明顯下降,細(xì)胞周期的檢測(cè)顯示:轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3和納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力療法共同作用后出現(xiàn)明顯的Sub-G1峰,凋亡指數(shù)為:24.65%。 結(jié)論:攜竹紅菌乙素的陽(yáng)離子納米脂質(zhì)體能有效地結(jié)合Rev-caspase-3質(zhì)粒。攜竹紅菌乙素的納米光敏劑能將Rev-caspase-3帶入NPC/CNE-2細(xì)胞內(nèi),表達(dá)活性Caspase-3,表明納米脂質(zhì)體是一種較好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體。轉(zhuǎn)染后的Rev-caspase-3和納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療能有效地殺滅鼻咽癌細(xì)胞,并且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明光動(dòng)力治療聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染可能是一種有前途的腫瘤治療策略。 第四部分:納米光敏劑介導(dǎo)的光化學(xué)轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3致鼻咽癌細(xì)胞凋亡 目的:明確攜竹紅菌乙素的納米光敏劑介導(dǎo)的光化學(xué)轉(zhuǎn)染能提高轉(zhuǎn)染的效率,轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響 方法:將轉(zhuǎn)染時(shí)納米光敏劑的劑量減少到4μM,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)光化學(xué)轉(zhuǎn)染后的Rev-caspase-3的表達(dá)水平。MTT法檢測(cè)光化學(xué)轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞儀檢測(cè)光化學(xué)轉(zhuǎn)染Rev-caspase-3后鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。 結(jié)果:光化學(xué)轉(zhuǎn)染時(shí):對(duì)照組的表達(dá)率為:1.48±0.51%,納米光敏劑4μM加質(zhì)粒4μg,未進(jìn)行光動(dòng)力處理時(shí)的表達(dá)率為39.78±3.59%,納米光敏劑4μM加質(zhì)粒4μg,光能量密度在0.1J/cm2時(shí),轉(zhuǎn)染率上升到59.45±3.63%;光能量密度在0.2J/cm2時(shí),轉(zhuǎn)染率降為54.09±2.26%。細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果:轉(zhuǎn)染后活性Caspase-3的表達(dá)率越高,其細(xì)胞的生存率越低。細(xì)胞周期檢測(cè)表明:轉(zhuǎn)染后活性Caspase-3的表達(dá)率越高,細(xì)胞的凋亡率越高。 結(jié)論:納米光敏劑可以作為轉(zhuǎn)染載體,將Rev-caspase-3轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi),并且該轉(zhuǎn)染效率被LED光源激發(fā)的光化學(xué)轉(zhuǎn)染作用所加強(qiáng)。光化學(xué)轉(zhuǎn)染作用是在一定能量的光作用下發(fā)生,其轉(zhuǎn)染效率不會(huì)隨著光能量的增加而增加,其原理可能和較高能量的光動(dòng)力作用破壞DNA的結(jié)構(gòu)。從而使DNA失活有關(guān)系。轉(zhuǎn)染后的Rev-caspase-3能自發(fā)激活、復(fù)制、表達(dá)活性Caspase-3,從而啟動(dòng)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,其細(xì)胞凋亡的數(shù)量與活性Caspase-3的表達(dá)效率正相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 萬(wàn)象義,張蔚玲,王啟方;竹紅菌中竹紅菌乙素的分離和鑒定[J];云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1985年04期

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本文編號(hào)：2368614