【摘要】：目的 1.通過532nm二極管激光光凝Wistar大鼠角膜緣血管網(wǎng),造成眼壓升高,評價(jià)該模型的穩(wěn)定性和可靠性。 2.觀察大鼠慢性高眼壓模型試驗(yàn)眼RGCs和LGN神經(jīng)元中HSP72的表達(dá)情況,與利用不同方法調(diào)節(jié)HSP72的表達(dá)水平相比較,了解HSP72表達(dá)改變后是否對RGCs和LGN具有保護(hù)作用。 3.觀察不同HSP72表達(dá)狀態(tài)下,試驗(yàn)眼RGCs和LGN神經(jīng)元中SAPK/JNK通路的活化情況；并與SAPK/JNK通路抑制劑sp600125的作用相比較,探討HSP72調(diào)控青光眼神經(jīng)損傷的機(jī)制。 方法 1.使用532nm二極管激光光凝Wistar大鼠的角膜緣血管網(wǎng)。30只Wistar大鼠按光凝前,光凝后3天、7天、14天和28天5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分為5組,每組6只,利用Tonopen-XL眼壓計(jì)于處死前測量眼壓；每組又分為2個(gè)亞組,第一個(gè)亞組大鼠3只,用于熒光金逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并計(jì)數(shù)；第2個(gè)亞組大鼠3只,并通過HE染色觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及外側(cè)膝狀體的形態(tài)學(xué)改變。 2.用腹腔注射硫酸鋅或槲皮素的方法誘導(dǎo)HSP72表達(dá)改變。動(dòng)物分組：A組為高眼壓組,Wistar大鼠30只；B組為硫酸鋅注射組,Wistar大鼠30只,每2周重復(fù)注射一次；C組為槲皮素注射組,Wistar大鼠30只。上述三組分別于激光前和眼壓升高后3天、7天、14天和28天5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)取材；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)又分為3個(gè)亞組,每個(gè)亞組2只大鼠；一個(gè)亞組用于熒光金逆行標(biāo)記計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；一個(gè)亞組用于免疫組織化學(xué)染色檢測HSP72的表達(dá)水平；另一個(gè)亞組用于western blotting檢測HSP72的表達(dá)水平。 3.用側(cè)腦室注射sp600125抑制SAPK/JNK的活化。對20只大鼠行側(cè)腦室sp600125注射,注射完畢后行激光；分別于激光前和眼壓升高后3天、7天、14天和28天5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只大鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)又分為2亞組,每亞組2只大鼠；第一亞組用于熒光金逆行標(biāo)記計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；第二亞組用于western blotting檢測p-JNK,p-c-jun的表達(dá)情況。 結(jié)果 1.通過532nm二極管激光光凝損傷角膜緣血管網(wǎng)成功建立了大鼠慢性青光眼模型,激光處理前試驗(yàn)眼平均眼壓為13.34±0.52mmHg,空白對照眼平均眼壓為13.16±0.3 mmHg；激光處理后3天,7天,14天和28天,試驗(yàn)眼平均眼壓分別為22.04±1.08 mmHg,28.84±1.38 mmHg,30.58±1.15 mmHg和：30.56±1.01mmHg；對照眼平均眼壓無明顯變化。激光處理前試驗(yàn)眼與對照眼眼壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.54),激光處理后各時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)眼較對照眼平均眼壓明顯升高,差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。隨著高眼壓持續(xù)時(shí)間的延長,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞逐漸出現(xiàn)胞體空泡化,胞核固縮,核碎裂以及細(xì)胞溶解；神經(jīng)纖維層和內(nèi)外核層逐漸變薄,內(nèi)外核層核排列紊亂,數(shù)目減少。長時(shí)間的高眼壓會引起外側(cè)膝狀體神經(jīng)元胞體水腫,胞核固縮,軸突減少以及軸突走向紊亂。視網(wǎng)膜鋪片RGCs計(jì)數(shù)平均為：眼壓升高前197.42±63.78個(gè)/視野,眼壓升高后3d組169.5±64.71個(gè)/視野,眼壓升高后7天組138.25±34.71個(gè)/視野,眼壓升高后14天組113.08±39.63個(gè)/視野,眼壓升高后28天組99.42±27.27個(gè)/視野；對照眼RGCs計(jì)數(shù)為：眼壓升高前198±63.17個(gè)/視野,眼壓升高后3天組194.67±64.14個(gè)/視野,眼壓升高后7天組196.67±67.90個(gè)/視野,眼壓升高后14天組194.83±69.6個(gè)/視野,眼壓升高后28天組199.42±27.27個(gè)/視野；激光處理后各時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)眼RGCs計(jì)數(shù)較對照眼明顯減少(P0.05)。 2.眼壓升高前,試驗(yàn)眼視網(wǎng)膜組織中未檢測到顯著的HSP72的表達(dá)；眼壓升高3天后RGCs中HSP72的表達(dá)達(dá)高峰,14天仍然可檢測到HSP72的表達(dá),28天后基本下降到稍高于正常眼的表達(dá)；眼壓升高3天后,LGN神經(jīng)元中也可以檢測到HSP72的表達(dá),但表達(dá)高峰較RGCs晚,大約在7天達(dá)高峰,28天亦回到基線水平；硫酸鋅注射組RGCs和LGN神經(jīng)元各時(shí)間點(diǎn)HSP72的表達(dá)均高于試驗(yàn)眼；槲皮素注射組RGCs和LGN神經(jīng)元各時(shí)間點(diǎn)HSP72的表達(dá)均顯著低于試驗(yàn)眼。視網(wǎng)膜鋪片RGCs計(jì)數(shù)平均為：硫酸鋅注射組,眼壓升高前198.83±70.07個(gè)/視野,眼壓升高后3天組173.75±58.44個(gè)/視野,眼壓升高后7天組146.92±31.8個(gè)/視野,眼壓升高后14天組129.67±29.49個(gè)/視野,眼壓升高后28天組120±24.8個(gè)/視野；槲皮素注射組,眼壓升高前199.58士66.44個(gè)/視野,眼壓升高后3天組163.5士67.57個(gè)/視野,眼壓升高后7天組120.92士47.12個(gè)/視野,眼壓升高后14天組96.25士42.82個(gè)/視野,眼壓升高后28天組80.75士44.7個(gè)/視野。激光處理前各時(shí)間點(diǎn)之間RGCs計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；激光處理后各時(shí)間點(diǎn),空白對照組,試驗(yàn)組,硫酸鋅注射組和槲皮素注射組四組兩兩比較皆有顯著差異(p0.05)。 3.試驗(yàn)組,硫酸鋅注射和sp600125注射組外側(cè)膝狀體神經(jīng)元均可檢測到SAPK/JNK信號通路中p-JNK和其下游的p-c-jun表達(dá)的增高；三組p-JNK的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異(P0.05)；而硫酸鋅注射組和sp600125注射組高眼壓眼視神經(jīng)投射的外側(cè)膝狀體區(qū)的p-c-jun表達(dá),較試驗(yàn)組高眼壓眼有明顯的下降(p0.05)。sp600125注射組RGCs平均計(jì)數(shù)為：眼壓升高前199.58士66.44個(gè)/視野,眼壓升高后3天組178.5士37.65個(gè)/視野,眼壓升高后7天組156.92士37.32個(gè)/視野,眼壓升高后14天組136.34士52.67個(gè)/視野,眼壓升高后28天組134.75士54.2個(gè)/視野；各時(shí)間點(diǎn)sp600125注射組RGCs計(jì)數(shù)均高于硫酸鋅注射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論 1.經(jīng)532nm二極管激光光凝損傷角膜緣血管網(wǎng)引起眼壓升高可建立慢性青光眼模型,能夠造成明顯的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷和丟失；并可引起LGN神經(jīng)元的損傷。 2.眼壓升高和硫酸鋅腹腔注射會誘導(dǎo)RGCs和外側(cè)膝狀體神經(jīng)元HSP72表達(dá)上調(diào),硫酸鋅誘導(dǎo)的HSP72高表達(dá)可減少RGCs的死亡率。 3.HSP72在RGCs和外側(cè)膝狀體神經(jīng)元中通過阻斷凋亡通路SAPK/ JNK的活化,發(fā)揮對青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)路神經(jīng)元的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R775

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本文編號：2341368