發(fā)布時間：2018-11-07 18:30

【摘要】：第一部分兩種小鼠耳蝸損傷方法的比較 目的： 比較兩種小鼠耳蝸損傷方法的效果。 方法： 采用兩種不同的方法損傷CBA/J小鼠耳蝸。第一種方案：卡那霉素700mg/kg,皮下注射,每日2次,連續(xù)14日。第二種方案：卡那霉素1000mg/kg,皮下注射,30-45min后呋塞米400mg/kg,腹腔注射。在給藥前、給藥結束后1天(d1)及給藥結束后7天(d7)應用聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)評估小鼠聽覺功能改變；在d7應用琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)染色評價毛細胞(hair cells, HCs)線粒體功能損傷情況。 結果： CBA/J小鼠在單獨應用卡那霉素后,ABR閾值在d1明顯升高,隨后在d7繼續(xù)升高。形態(tài)學結果顯示耳蝸底回絕大部分外毛細胞(outer hair cells, OHCs) SDH活性消失,而內(nèi)毛細胞(inner hair cells, IHCs) SDH活性保存完好；頂回部分OHCs SDH活性減弱,而IHCs SDH活性絕大部分保存完好。CBA/J小鼠在聯(lián)合應用卡那霉素及呋塞米后,ABR閾值同樣在d1明顯升高,在d7繼續(xù)升高,且最終閾移大于單獨應用卡那霉素之閾移。形態(tài)學結果顯示耳蝸底回及頂回OHCs SDH活性完全消失,而IHCsSDH活性保存完好。 結論： 兩種方法均能造成小鼠耳蝸損傷,但聯(lián)合應用卡那霉素及呋塞米較單獨應用卡那霉素對耳蝸損傷程度更大,且操作更簡便。 第二部分聯(lián)合應用卡那霉素和呋塞米快速誘導小鼠耳蝸損傷 目的： 探討卡那霉素和呋塞米聯(lián)合應用對小鼠耳蝸的毒性作用,建立一種可靠的小鼠感音神經(jīng)性聾模型。 方法： 選用3-4周齡的CBA/J小鼠為實驗對象,按1000mg/kg的劑量皮下注射卡那霉素,30-45min后按400mg/kg的劑量腹腔注射呋塞米。在注射前、注射后12小時(d0.5)、1天(d1)、2天(d2)、7天(d7)、14天(d14)、28天(d28)及112天(d112)分別應用聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)檢測小鼠聽覺功能的改變；應用異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽及碘化丙錠染色、半薄切片甲苯胺藍染色、脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, TUNEL)技術、掃描電鏡等觀察小鼠毛細胞(hair cells, HCs)和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(spiral ganglion neurons, SGNs)死亡的模式和程度。 結果： 小鼠ABR閾值在d0.5開始上升,隨后至d2期間繼續(xù)進行性上升,繼而趨于穩(wěn)定在90 dB SPL左右。應用激光共聚焦顯微鏡在d0.5觀察到耳蝸底回外毛細胞(outer hair cells, OHCs)開始出現(xiàn)死亡,d1時底回OHCs基本全部消失,同時頂回OHCs開始出現(xiàn)死亡,至d2時整個耳蝸OHCs絕大部分死亡；而內(nèi)毛細胞(inner hair cells, IHCs)的損傷至d7時才開始出現(xiàn),隨時間推移仍有部分IHCs完好無損。TUNEL結果顯示死亡的HCs均具有典型的凋亡細胞特征。掃描電鏡顯示卡那霉素和呋塞米聯(lián)合應用后HCs首先出現(xiàn)纖毛消失,表皮板塌陷,隨后支持細胞增生并在該處形成瘢痕。SGNs在d2保持完整,但在d7開始出現(xiàn)體積減小,d14天出現(xiàn)數(shù)量減少,至d28大部分死亡,至d112僅余少數(shù)細胞殘留。 結論： 單劑量序貫應用卡那霉素及呋塞米能快速誘導小鼠耳蝸HCs大量死亡,并能造成SGNs延遲性死亡,適用于建立小鼠感音神經(jīng)性聾模型。 第三部分小鼠耳蝸外側壁在感音神經(jīng)性聾發(fā)生后的反應 目的： 探討感音神經(jīng)性聾發(fā)生后小鼠耳蝸外側壁形態(tài)和功能的改變。 方法： 選用3-4周齡的CBA/J小鼠為實驗對象,聯(lián)合應用卡那霉素及呋塞米致聾。在給藥后12小時(d0.5)、1天(d1)、2天(d2)、7天(d7)、14天(d14)、28天(d28)及112天(d112)監(jiān)測耳蝸內(nèi)電位(endocochlear potential, EP)的改變；應用蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色、掃描電鏡、透射電鏡、免疫化學、逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)等方法檢測耳蝸外側壁形態(tài)以及四種K+轉運蛋白α1,a 2Na,K-ATPase、NKCC1和KCNQ1的變化。 結果： 小鼠EP自d0.5開始下降,至d1進行性下降,至d2完全恢復正常并在隨后長時期保持穩(wěn)定。HE染色顯示毛細胞損失和耳蝸外側壁萎縮是主要病理改變。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)血管紋表面邊緣細胞在給藥后出現(xiàn)胞體腫脹,隨后邊緣細胞表面大部分微絨毛消失,胞體呈“石塊”樣改變。透射電鏡結果顯示血管紋厚度在致聾后進行性下降,主要為邊緣細胞萎縮造成。免疫化學結果表明耳蝸外側壁α1,a 2Na,K-ATPase和NKCC1的蛋白表達水平明顯下降,而KCNQ1的蛋白表達水平無明顯改變。RT-PCR結果同樣提示α1,a 2Na,K-ATPase和NKCC1 mRNA的表達水平下降而KCNQ1 mRNA的表達水平未受影響。 結論： 萎縮后的耳蝸外側壁在毛細胞嚴重缺失的情況下仍然可以保證EP的正常維持,其原因可能是a 1, a 2Na,K-ATPase和NKCC1的共同下調使K+在耳蝸外側壁的轉運在一個新的水平上達到平衡。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R764

【參考文獻】

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1 褚漢啟;黃孝文;熊浩;韓芳;吳振恭;周良強;崔永華;;小鼠耳蝸側壁α_2 Na,K-ATPase在聽覺及年齡相關性聽力下降中的作用[J];聽力學及言語疾病雜志;2006年06期

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3 熊浩;褚漢啟;韓芳;吳振恭;張平;王春芳;崔永華;;卡那霉素對三種小鼠耳毒性比較及對血管紋Na-K-2Cl聯(lián)合轉運子1表達的影響[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2006年01期

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本文編號：2317224