【摘要】：在耳科學(xué)領(lǐng)域,探索耳蝸的發(fā)育機(jī)制和毛細(xì)胞的再生機(jī)制是兩個(gè)具有挑戰(zhàn)性的難題。在新生的鼠類耳蝸內(nèi),仍然能夠分離和培養(yǎng)出具有增殖能力的前體細(xì)胞,這些耳蝸前體細(xì)胞(CPCs)在體外能夠分化出耳蝸毛細(xì)胞以及其他種類的耳蝸細(xì)胞。這些前體細(xì)胞被認(rèn)為可能應(yīng)用于毛細(xì)胞損傷缺失后的替代治療,更重要的是,在體外誘導(dǎo)分化這些前體細(xì)胞可以為我們提供一個(gè)研究耳蝸發(fā)育和毛細(xì)胞再生的體外模型。 microRNA(miRNA)是一類能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及干細(xì)胞命運(yùn)的內(nèi)源性非編碼小RNA。目前尚無(wú)關(guān)于miRNA在耳蝸前體細(xì)胞增殖和分化中表達(dá)和功能的研究。在本研究中,我們首次利用微芯片及實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在CPCs分化過(guò)程中表達(dá)的全部miRNA及其表達(dá)模式,與神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)比較后,發(fā)現(xiàn)miR-183家族具有CPC細(xì)胞表達(dá)特異性。這些結(jié)果表明miRNA可能在CPC的增殖和分化中發(fā)揮了不同的作用,還可能決定了CPC向毛細(xì)胞的定向分化。 使CPCs過(guò)表達(dá)目的miRNA或目的miRNA的互補(bǔ)反義鏈可以分別通過(guò)“gain-of-function”和“l(fā)oss-of-function”實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA功能的驗(yàn)證。但目前尚無(wú)成功轉(zhuǎn)染CPCs的相關(guān)報(bào)道。我們首次觀察和比較了三種不同的轉(zhuǎn)染方法對(duì)CPCs的轉(zhuǎn)染率和對(duì)細(xì)胞存活率的影響。初步證明了腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)是使耳蝸前體細(xì)胞過(guò)表達(dá)目的基因的最佳途徑與方法。 實(shí)驗(yàn)一耳蝸前體細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和分化 目的分離、培養(yǎng)新生大鼠仔鼠耳蝸中的前體細(xì)胞(cochlear progenitor cells,CPCs)和胚胎鼠中來(lái)源于嗅球部位的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs),并對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化。 方法從新生0至3天的大鼠耳蝸基底膜中分離出CPCs,進(jìn)行原代培養(yǎng),分別用免疫細(xì)胞熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)BrdU和nestin在CPCs中的表達(dá)情況,鑒定前體細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞特性。用血清誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化,用免疫細(xì)胞熒光的方法檢測(cè)CPCs是否具有分化成毛細(xì)胞的能力。從發(fā)育15天的SD大鼠胚胎鼠的嗅球中分離出NSCs,并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。用血清誘導(dǎo)傳代第4代的NSCs進(jìn)行分化。 結(jié)果原代培養(yǎng)的CPCs第18小時(shí)后可見(jiàn)少量細(xì)胞球形成,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),可見(jiàn)細(xì)胞球數(shù)量逐漸增多,組成細(xì)胞球的細(xì)胞數(shù)目也增多。細(xì)胞球內(nèi)絕大部分細(xì)胞BrdU和nestin陽(yáng)性。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞球的形態(tài)發(fā)生改變,增殖能力明顯下降,而且部分細(xì)胞球自行貼壁,無(wú)法進(jìn)行嚴(yán)格意義上的傳代。經(jīng)分化誘導(dǎo)后,細(xì)胞球貼壁生長(zhǎng),14天后,對(duì)分化細(xì)胞行免疫熒光化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosin VIIA。NSCs增殖能力非常強(qiáng),可傳至少40代,持續(xù)6個(gè)月,分化后的細(xì)胞形態(tài)與CPCs來(lái)源的分化細(xì)胞顯著不同。 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)表明CPCs具有一定的增殖能力,也可以分化出毛細(xì)胞樣細(xì)胞,但并非嚴(yán)格意義上的干細(xì)胞,只能稱其為耳蝸來(lái)源的前體細(xì)胞,它可作為耳蝸發(fā)育和毛細(xì)胞再生的體外研究模型。本部分實(shí)驗(yàn)為研究和比較miRNA在CPCs和NSCs分化過(guò)程中的表達(dá)變化奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)二耳蝸前體細(xì)胞分化過(guò)程中miRNA的表達(dá)變化 目的miRNA具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和影響細(xì)胞命運(yùn)的重要作用。目前關(guān)于miRNA在CPCs中的表達(dá)和功能研究尚未見(jiàn)任何報(bào)道。我們擬用高通量的miRNA芯片檢測(cè)目前已知所有的miRNA在CPCs增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)模式。 方法收集CPCs細(xì)胞球和CPCs來(lái)源的分化6天和14天的細(xì)胞,提取總RNA,通過(guò)質(zhì)量檢測(cè)后用Hy3標(biāo)記探針,用LNA miRNA芯片進(jìn)行雜交,然后掃描芯片并分析所有目前已知的miRNA的表達(dá)熒光信號(hào)強(qiáng)度,經(jīng)過(guò)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)處理后繪制miRNA的表達(dá)模式圖。分析并比較每個(gè)miRNA在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。 結(jié)果近有100個(gè)miRNA在CPCs的分化過(guò)程中可以檢測(cè)到。隨著分化的進(jìn)行,大部分的miRNA都出現(xiàn)明顯的表達(dá)變化。這些miRNA之間的表達(dá)豐度跨度巨大,而且具有不同的表達(dá)模式,miR-125b-5p, miR-494和miR-22是表達(dá)量最高的三個(gè)miRNA。在檢測(cè)到的miRNA中,最為常見(jiàn)的三種表達(dá)模式是:1.在未分化狀態(tài)下表達(dá)水平達(dá)到峰值; 2.在分化第6天的時(shí)候表達(dá)水平達(dá)到峰值; 3.在分化第14天的時(shí)候表達(dá)水平達(dá)到峰值。 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)表明在CPCs不同分化階段,具有不同的miRNA表達(dá)譜系。miRNA表達(dá)水平的時(shí)序性調(diào)節(jié)變化暗示著這些miRNA在不同的分化階段發(fā)揮不同的作用。 實(shí)驗(yàn)三實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較miRNA在不同種類細(xì)胞中的表達(dá)模式 目的用miRNA時(shí)實(shí)定量RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果,檢測(cè)miR-21、miR-503、let-7a和let-7f及miR-183家族在CPCs分化過(guò)程中的表達(dá)變化,檢測(cè)miR-183家族在NSCs分化過(guò)程中的表達(dá)變化。對(duì)比miR-183家族在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。 方法收集CPCs細(xì)胞球和CPCs來(lái)源的分化6天和14天的細(xì)胞,提取總RNA,用miRNA qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-21、miR-503、let-7a、let-7f、miR-96、miR-182和miR-183在三個(gè)分化時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。收集NSCs細(xì)胞球和NSCs來(lái)源的分化6天和14天的細(xì)胞,提取總RNA,用miRNA qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-183家庭在三個(gè)分化時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。 結(jié)果miR-21、miR-503、let-7a和let-7f的表達(dá)趨勢(shì)與其在miRNA芯片中的結(jié)果基本一致。miR-21、let-7a和let-7f具有相似的表達(dá)模式,均在分化6天的時(shí)候達(dá)到峰值。而miR-503具有不同的表達(dá)模式,隨著分化的進(jìn)行,miR-503的表達(dá)水平逐漸升高,在分化第14天階段表達(dá)水平達(dá)到高峰,此變化亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-183家族的三個(gè)成員表達(dá)模式不同,miR-96和miR-182的表達(dá)量均隨著分化的進(jìn)行不斷下降,而miR-183的表達(dá)與miR-21相似在分化6天時(shí)達(dá)到高峰。miR-96和miR-183均無(wú)法在NSCs分化過(guò)程中檢測(cè)到,miR-182僅能在未分化的NSCs中檢測(cè)到,但表達(dá)量極低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè),以上變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了LNA芯片結(jié)果的可靠性。在CPCs分化中不同的miRNA可能有類似的功能。miR-183家族具有CPC的細(xì)胞表達(dá)特異性,這種特導(dǎo)性可能影響了干細(xì)胞向CPCs的分化,也可能決定了CPCs向多種耳蝸細(xì)胞的特異性分化。 實(shí)驗(yàn)四耳蝸前體細(xì)胞過(guò)表達(dá)目的基因方法的建立 目的能夠使CPCs過(guò)表達(dá)或低表達(dá)miRNA是驗(yàn)證miRNA功能的首要條件。但目前尚無(wú)成功轉(zhuǎn)染CPCs的相關(guān)報(bào)道。我們分別觀察脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染和腺病毒感染三種方法對(duì)原代培養(yǎng)的CPCs的轉(zhuǎn)染率。為日后研究miRNA在CPCs中發(fā)揮的作用奠定實(shí)驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)。 方法用不同比例的EGFP質(zhì)粒/脂質(zhì)體復(fù)合物和不同的孵育時(shí)間轉(zhuǎn)染CPCs;設(shè)置不同的電場(chǎng)強(qiáng)度用電穿孔轉(zhuǎn)染法將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CPCs;按照不同MOI值加入rAd-EGFP,用腺病毒介導(dǎo)的方法使CPCs表達(dá)EGFP。24小時(shí)后在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)算轉(zhuǎn)染率。用臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)觀察各種條件下的不同轉(zhuǎn)染法的細(xì)胞存活率。 結(jié)果改變不同的轉(zhuǎn)染條件后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率無(wú)明顯改變,平均轉(zhuǎn)染率低于2%,但對(duì)細(xì)胞的存活不產(chǎn)生明顯的影響;增加電穿孔的電壓后,轉(zhuǎn)染率在一定的電壓范圍內(nèi)明顯上升,在電壓強(qiáng)度為250V時(shí)達(dá)到最高,平均轉(zhuǎn)染率為24.7%,但是細(xì)胞存活率相對(duì)較低;腺病毒感染法的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)率在MOI值為250時(shí)達(dá)到高峰為52%,細(xì)胞的存活率可達(dá)到85%。 結(jié)論本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染率過(guò)低;電穿孔轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染率有了大幅度的提高但細(xì)胞死亡過(guò)多;腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)法兼顧了轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞存活率,是使CPCs過(guò)表達(dá)目的基因的最合適的方法。但是我們需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和更為詳盡的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)支持本結(jié)論。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R764.43

【參考文獻(xiàn)】

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1 蔡磊;李艷;竇科峰;張巍;丁睿;趙青川;;電穿孔轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞條件的優(yōu)化[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2008年04期

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本文編號(hào)：2276803