【摘要】：第一部分CREB1在小鼠OIR模型中的表達變化 目的研究環(huán)腺苷酸反應成分結(jié)合蛋白1(CREB1)在小鼠氧誘導視網(wǎng)膜病變(OIR)模型視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達變化,尋找病理性視網(wǎng)膜新生血管形成的可能機制。 方法選用7d齡的健康清潔級C57BL/6J小鼠134只,隨機分為正常對照組(n=67)和OIR模型組(n=67)。將小鼠與哺乳母鼠共同置于(75±2)%氧環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)5d后轉(zhuǎn)移至正常環(huán)境中飼養(yǎng)9d,建立小鼠OIR模型,正常對照組在正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)21d。出生后第17d時取OIR模型組和正常對照組小鼠制備視網(wǎng)膜切片HE染色法和FITC-dextran心臟灌注視網(wǎng)膜鋪片法觀察視網(wǎng)膜新生血管情況,以及視網(wǎng)膜組織冰凍切片免疫熒光染色觀察P-CREB1表達情況。取2組鼠第7、9、12、14、17、21d的視網(wǎng)膜分別采用實時定量聚合酶鏈反應(1eal-time PCR)法和Western Blot法檢測CREB1mRNA和P-CREB1蛋白在小鼠視網(wǎng)膜中的表達情況。兩組相同時間點之間的比較采用獨立樣本t檢驗；兩組間多時間點的比較采用兩因素方差分析方法進行分析,兩兩差異比較采用Bonferroni post-test檢驗。 結(jié)果17d時視網(wǎng)膜切片HE染色顯示OIR模型組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的內(nèi)皮細胞核數(shù)明顯增加,與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(t=11.31,P0.05),模型組視網(wǎng)膜新生血管區(qū)及無灌注區(qū)面積分別為(30.61±3.12)%和(21.40±2.72)%。模型組小鼠視網(wǎng)膜中可見大量P-CREB1蛋白熒光主要表達在內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層。Real-time PCR和Western Blot結(jié)果表明,正常對照組第7、9、12、14、17d時CREB1mRNA和P-CREB1蛋白在視網(wǎng)膜中的表達水平呈逐漸升高,21d時開始出現(xiàn)下降：在各相應時間點OIR模型組里的CREB1相對表達量除第7d時,其余時間均高于正常對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論CREB1的表達水平與視網(wǎng)膜新生血管的形成存在時空對應關(guān)系,CREB1的高表達可能參與了氧誘導視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜新生血管的形成過程。 第二部分針對CREB1的siR NA慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝 目的：設(shè)計、構(gòu)建及包裝針對小鼠CREB1基因的小干擾RNA(siRNA)慢病毒載體,為將來進一步的實驗提供實驗工具及完善理論依據(jù)。 方法：1.選用質(zhì)粒pLenR-GPH Vector作為載體用于構(gòu)建基因CREB1小干擾RNA表達載體；2.根據(jù)NCBI nucleotide CREB1的mRNA序列,設(shè)計針對小鼠CREBl基因的2個特異性siRNA靶序列,合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo,直接連入酶切后的載體上；3.將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆做PCR鑒定,鑒定陽性的克隆擴增后提取質(zhì)粒,進一步做測序鑒定；4.測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的CREB1小干擾RNA慢病毒質(zhì)粒。5.流式細胞法測定包裝后的重組CREB1siRNA慢病毒滴度。 結(jié)果：成功構(gòu)建并包裝了攜帶EGFP標簽的針對小鼠CREB1基因的siRNA慢病毒載體；重組的CREB1siRNA慢病毒質(zhì)粒滴度≥1.5×109TU/ml。 結(jié)論：攜帶EGFP針對小鼠CREB1目的基因的小干擾RNA序列的慢病毒載體已成功構(gòu)建及包裝,且重組CREB1siRNA慢病毒滴度高,符合動物實驗所需,是我們后續(xù)研究CREB1基因功能的強有力的實驗工具。 第三部分慢病毒介導CREB1特異性siRNA對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用及其機制 目的觀察玻璃體腔注射慢病毒介導的環(huán)腺苷酸反應成分結(jié)合蛋白1(CREB1)特異性小干擾RNA (siRNA)對氧誘導視網(wǎng)膜病變(OIR)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用。 方法將140只5日齡C57BL/6J小鼠均分為正常對照組、氧誘導視網(wǎng)膜病變模型組、空載體組和CREB1干擾組(n=35)。正常對照組小鼠在正�？諝庵酗曫B(yǎng)。OIR模型組、空載體組和CREB1干擾組小鼠均按照前面的方法建立OIR模型。OIR模型組不予治療�？蛰d體組及CREB1干擾組小鼠于出生后5d分別行玻璃體腔注射不含目的基因干擾片段的慢病毒空載體(CREB1-NC-siRNA)和攜帶目的基因CREB1特異性小干擾RNA的慢病毒載體(CREB1-siRNA)各1.0μl。第12d時熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。第17d時免疫熒光檢測磷酸化CREB1的表達,觀察CREB1基因的干擾效果。計數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細胞核數(shù)和熒光血管造影視網(wǎng)膜鋪片評價視網(wǎng)膜新生血管情況；計算小鼠視網(wǎng)膜新生血管和無灌注區(qū)面積；實時定量聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測小鼠視網(wǎng)膜CREB1mRNA和磷酸化CREB1(P-REB1)蛋白表達,以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的mRNA和蛋白表達情況。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較。 結(jié)果玻璃體腔注射慢病毒一周后,干擾組和空載體組視網(wǎng)膜內(nèi)見大量綠色熒光蛋白的表達,而正常對照組和模型組視網(wǎng)膜切片中無綠色熒光蛋白的表達。第17天時免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)模型組和空載體組中大量P-CREB1熒光蛋白在視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層表達,而CREB1干擾組中熒光蛋白表達明顯減少。正常對照組視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細胞層中僅見少量熒光蛋白。突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核計數(shù)在干擾組和空載組、模型組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=50.48,P0.01)。熒光血管造影顯示正常組視網(wǎng)膜深淺層血管分布均勻,未見血管閉塞、新生血管區(qū)及無灌注區(qū)。其他三組均可見無血管區(qū)及新生血管區(qū)。CREB1干擾組新生血管及無灌注區(qū)面積明顯較OIR模型組和空載組減少(F=110.09, P0.01; F=67.22, P0.01); OIR模型組和空載體組間新生血管及無灌注區(qū)面積差異無統(tǒng)計學意義(P=0.917；P=0.877)。OIR模型組、空載組小鼠視網(wǎng)膜CREB1mRNA和P-CREB1蛋白表達以及VEGF-A、Akt、PI3K mRNA和蛋白表達均較正常對照組明顯增加；CREB1干擾組小鼠視網(wǎng)膜CREB1mRNA和P-CREB1蛋白表達以及VEGF-A、Akt、 PI3K、mRNA和蛋白表達較OIR模型組、空載組明顯下降。4組小鼠視網(wǎng)膜CREB1、VEGF-A, Akt、PI3K mRNA表達比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.087、5.464,6.191、8.627,P0.05)。4組小鼠視網(wǎng)膜P-CREB1、VEGF-A、Akt、PI3K蛋白表達比較,差異也有統(tǒng)計學意義(F=162.944、13.861、19.710、22.827, P0.05)。 結(jié)論玻璃體腔注射慢病毒介導的CREB1siRNA轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜可有效抑制氧誘導小鼠視網(wǎng)膜新生血管的形成,其作用可能與下調(diào)PI3K/Akt及VEGF-A的作用有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R774.1

【參考文獻】

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1 李O燦，

本文編號：2276253