【摘要】： 耳蝸毛細(xì)胞可將聲波的震動(dòng)轉(zhuǎn)化為生物電信號(hào),是聽覺系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。但毛細(xì)胞極易因噪音、藥物和年齡等因素受損,而哺乳動(dòng)物的耳蝸毛細(xì)胞沒有天然的再生能力,一旦受到損傷,即可造成永久性的聽力喪失。但是在低等的脊椎動(dòng)物中,毛細(xì)胞的損傷可誘導(dǎo)周圍的支持細(xì)胞分裂增殖和向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,最終替代受損毛細(xì)胞,維持和恢復(fù)感覺上皮的功能,提示支持細(xì)胞可能是再生毛細(xì)胞的潛在干細(xì)胞。最近研究結(jié)果顯示體外分離培養(yǎng)的小鼠耳蝸支持細(xì)胞也能夠增殖并向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)分化,并且該過(guò)程中出現(xiàn)了細(xì)胞周期抑制因子的下調(diào),表明在哺乳動(dòng)物耳蝸內(nèi),支持細(xì)胞也可能具有毛細(xì)胞再生潛力,且細(xì)胞周期抑制因子的下調(diào)很可能對(duì)其重新進(jìn)入細(xì)胞周期的啟動(dòng)起到重要推動(dòng)作用。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)是細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用的抑制因子,可以抑制完成細(xì)胞周期所需基因的表達(dá)。在感覺前體細(xì)胞中定向敲除Rb基因,可使前體細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于增殖狀態(tài),并分化出大量毛細(xì)胞和支持細(xì)胞。但Rb基因在小鼠耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)定向敲除后,雖然毛細(xì)胞也能進(jìn)入細(xì)胞周期,但并不能完成分裂并引起細(xì)胞的增殖,反而啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡。目前,Rb在耳蝸支持細(xì)胞的表達(dá)和作用并不明確。本課題通過(guò)在出生后的小鼠耳蝸支持細(xì)胞內(nèi)定向敲除Rb基因,對(duì)哺乳動(dòng)物耳蝸支持細(xì)胞在毛細(xì)胞再生中的潛能進(jìn)行研究,以期為耳蝸毛細(xì)胞再生的機(jī)制研究和臨床治療提供更有效的方案。 (1)建立檢測(cè)Cre重組酶活性的指示模型小鼠。①將Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-LacZ指示小鼠相雜交,獲取Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠,從而在具有Cre重組酶活性的細(xì)胞中表達(dá)β-半乳糖酐酶(β-gal)。②通過(guò)X-gal染色,檢測(cè)耳蝸中的β-gal活性,從而顯示Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中具有Cre重組酶活性的細(xì)胞。 (2)誘導(dǎo)Cre重組酶活性。分別在P0和P1,按每日1次,每次3mg/40g體重劑量,對(duì)新生的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠進(jìn)行腹腔注射tamoxifen。 (3)檢測(cè)經(jīng)tamoxifen誘導(dǎo)后的Prox1-CreERT2小鼠耳蝸內(nèi),Cre重組酶活性的分布情況。①對(duì)新生的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠進(jìn)行腹腔注射tamoxifen,時(shí)間和劑量同上,以誘導(dǎo)Cre重組活性。②對(duì)接受過(guò)tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠,在P6采集其耳蝸進(jìn)行冰凍切片和耳蝸鋪片,利用X-gal染色并結(jié)合毛細(xì)胞特異性標(biāo)記抗體Myo7a的雙重染色,以顯示具有Cre重組酶活性的細(xì)胞及其相對(duì)于耳蝸毛細(xì)胞的位置。 (4)Cre重組酶活性在不同支持細(xì)胞亞型中的分布情況。①將Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-EYFP指示小鼠相雜交,獲取Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠,從而在具有Cre重組酶活性的細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP).②對(duì)Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠進(jìn)行tamoxifen腹腔注射,時(shí)間和劑量同上,以誘導(dǎo)Cre重組活性。③對(duì)接受過(guò)tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠,在P4采集耳蝸,制作鋪片,利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡的三維重建技術(shù),觀察耳蝸內(nèi)表達(dá)EYFP的細(xì)胞,并分析其與毛細(xì)胞和支持細(xì)胞的關(guān)系,使EYFP陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞類型得到進(jìn)一步確定。 (1)建立耳蝸支持細(xì)胞中定向敲除Rb基因的小鼠模型。①將Prox1-CreERT2小鼠與RbloxP/loxP小鼠雜交,獲取Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠。②分別于P0和P1腹腔注射tamoxifen,劑量同前,以誘導(dǎo)Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠體內(nèi)發(fā)生Cre重組酶介導(dǎo)的Rb基因敲除。 (2)檢測(cè)耳蝸支持細(xì)胞失去Rb作用后是否重新進(jìn)入了細(xì)胞周期。①接受過(guò)tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠(即Prox1-Rb-/-小鼠),在P4或P6對(duì)其進(jìn)行BrdU或EdU的腹腔注射,以標(biāo)記此時(shí)重新進(jìn)入細(xì)胞周期的耳蝸支持細(xì)胞。②通過(guò)免疫熒光染色(適用于BrdU)或共價(jià)疊氮反應(yīng)(適用于EdU),并結(jié)合毛細(xì)胞或支持細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白的雙重?zé)晒馊旧?檢測(cè)重新進(jìn)入細(xì)胞周期的耳蝸支持細(xì)胞。③在Prox1-Rb-/-耳蝸?lái)�、中、底回的相�?yīng)位置,分別對(duì)BrdU陽(yáng)性支持細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。④將Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)增殖性的支持細(xì)胞分布,與Prox1-CreERT2小鼠耳蝸內(nèi)Cre重組酶的分布情況進(jìn)行比較與分析。 (3)檢測(cè)耳蝸支持細(xì)胞失去Rb作用后是否可以完成細(xì)胞周期并增殖。①檢測(cè)Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的染色質(zhì)凝集現(xiàn)象,以及其支持細(xì)胞pH3的分子表達(dá)情況,以研究通過(guò)限制點(diǎn)和S期的Prox1-Rb-/-耳蝸支持細(xì)胞能否進(jìn)入M期。②在Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)進(jìn)行BrdU和FISH(可檢測(cè)DNA處于已被復(fù)制狀態(tài)還是未被復(fù)制狀態(tài))的雙重染色,以研究重新進(jìn)入細(xì)胞周期的支持細(xì)胞是否可以完成有絲分裂。③對(duì)Prox1-Rb-/-小鼠進(jìn)行BrdU和EdU的雙重標(biāo)記,以研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細(xì)胞是否具有多次進(jìn)入細(xì)胞周期的潛能。④通過(guò)外指細(xì)胞和柱細(xì)胞的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),以研究失去Rb作用的耳蝸支持細(xì)胞是否真正產(chǎn)生了增殖反應(yīng)。 (1)觀察Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸中的細(xì)胞凋亡情況。①對(duì)不同日齡的Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸進(jìn)行TUNEL染色,以檢測(cè)最早出現(xiàn)凋亡的時(shí)間和支持細(xì)胞亞型。②在P9對(duì)Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片中的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì),并與對(duì)照組比較以了解Rb基因缺陷的支持細(xì)胞凋亡情況。③對(duì)不同日齡Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片進(jìn)行Myo7a或Myo6免疫熒光染色,以檢測(cè)毛細(xì)胞數(shù)量是否受到影響。 (2)研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細(xì)胞在增殖后的細(xì)胞分化命運(yùn)。①分別在P4-P5或P8-P14每日1次對(duì)Prox1-Rb-/-小鼠進(jìn)行EdU的腹腔注射,通過(guò)EdU染色結(jié)合毛細(xì)胞和/或支持細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白Myo6、Prox1和Sox2的多重?zé)晒馊旧?以檢測(cè)Rb基因缺陷的支持細(xì)胞在增殖過(guò)程中的分化命運(yùn)。②研究在耳蝸內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性毛細(xì)胞丟失的情況下,其分化是否會(huì)受到影響,探討如何對(duì)哺乳動(dòng)物耳蝸支持細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)控,可以使其對(duì)毛細(xì)胞再生發(fā)揮最大的潛能。 分別在P0和P1,按3mg/40g體重劑量腹腔注射tamoxifen, Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中Cre重組酶的活性局限于外指細(xì)胞和柱細(xì)胞內(nèi)。而且,具有重組酶活性的細(xì)胞數(shù)量從耳蝸底回至頂回呈逐漸上升的趨勢(shì)。在Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠耳蝸?lái)敾氐腅YPF陽(yáng)性細(xì)胞中,外指細(xì)胞和柱細(xì)胞分別為72.77%±1.12%和27.23%±1.12%,即具有Cre重組酶活性的支持細(xì)胞大多為外指細(xì)胞。 在Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸內(nèi),發(fā)現(xiàn)外指細(xì)胞和柱細(xì)胞部位有BrdU陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。在毛細(xì)胞分布的位置有時(shí)也會(huì)發(fā)現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,但這些細(xì)胞都表達(dá)支持細(xì)胞抗原Prox1,而不表達(dá)毛細(xì)胞抗原Myo7a。從耳蝸底回至頂回,BrdU陽(yáng)性支持細(xì)胞的數(shù)量呈漸增的趨勢(shì)。在P4時(shí),BrdU陽(yáng)性的柱細(xì)胞數(shù)量明顯多于外指細(xì)胞。至P6時(shí),與對(duì)照組相比,Rb基因缺失后支持細(xì)胞數(shù)量明顯增多。 Rb基因缺失的外指細(xì)胞和柱細(xì)胞都可進(jìn)入細(xì)胞有絲分裂期(M期),表達(dá)M期特有的蛋白和具有M期特征性的凝集染色質(zhì)。在P6的BrdU陽(yáng)性柱細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其僅含2個(gè)FISH信號(hào)點(diǎn),顯示G1期或早期S期的特征,表明其重新進(jìn)入細(xì)胞周期后已完成了細(xì)胞分裂。在Prox1-Rb-/-耳蝸中還發(fā)現(xiàn)有BrdU/EdU雙重染色陽(yáng)性的柱細(xì)胞存在,提示其具有進(jìn)行多次細(xì)胞分裂的潛能。 在P5之前的Prox1-Rb-/-耳蝸切片上,并未見到Corti器內(nèi)出現(xiàn)TUNEL陽(yáng)性的支持細(xì)胞,而在P7的Prox1-Rb-/-耳蝸鋪片上,我們首先觀察到了Corti器中的凋亡細(xì)胞。從TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞位置推測(cè),這些最早出現(xiàn)死亡信號(hào)的細(xì)胞很可能是那些細(xì)胞核遷移至毛細(xì)胞層的外指細(xì)胞。之后Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸繼發(fā)毛細(xì)胞死亡,其毛細(xì)胞數(shù)量在P9并未發(fā)生顯著改變,但在P12的耳蝸?lái)敾乜梢娏阈堑拿?xì)胞丟失,在出生后7周的耳蝸鋪片上可見更嚴(yán)重的毛細(xì)胞丟失。并且在P12和P21耳蝸?lái)敾氐拿?xì)胞丟失比底回更嚴(yán)重。5周齡的Prox1-Rb-/-小鼠聽性腦干反應(yīng)(ABR)測(cè)試顯示聽閾上升,聽覺能力明顯低于對(duì)照組。 在P4時(shí),Peox1-Rb-/-耳蝸所有EdU陽(yáng)性細(xì)胞均可被Prox1和Sox2所標(biāo)記,證實(shí)了增殖中的Rb基因缺陷的支持細(xì)胞在重新進(jìn)入細(xì)胞周期后仍保持支持細(xì)胞的分化命運(yùn)。在有毛細(xì)胞丟失的位置,增殖約1周的外指細(xì)胞和柱細(xì)胞也仍保持支持細(xì)胞命運(yùn),所有EdU陽(yáng)性的耳蝸支持細(xì)胞在P14均可表現(xiàn)Sox2的雙重標(biāo)記,并且未發(fā)現(xiàn)任何EdU和Myo6雙重陽(yáng)性的細(xì)胞。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R764

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2273860