【摘要】： 耳蝸毛細胞可將聲波的震動轉(zhuǎn)化為生物電信號,是聽覺系統(tǒng)的關鍵組成部分。但毛細胞極易因噪音、藥物和年齡等因素受損,而哺乳動物的耳蝸毛細胞沒有天然的再生能力,一旦受到損傷,即可造成永久性的聽力喪失。但是在低等的脊椎動物中,毛細胞的損傷可誘導周圍的支持細胞分裂增殖和向毛細胞轉(zhuǎn)分化,最終替代受損毛細胞,維持和恢復感覺上皮的功能,提示支持細胞可能是再生毛細胞的潛在干細胞。最近研究結(jié)果顯示體外分離培養(yǎng)的小鼠耳蝸支持細胞也能夠增殖并向毛細胞轉(zhuǎn)分化,并且該過程中出現(xiàn)了細胞周期抑制因子的下調(diào),表明在哺乳動物耳蝸內(nèi),支持細胞也可能具有毛細胞再生潛力,且細胞周期抑制因子的下調(diào)很可能對其重新進入細胞周期的啟動起到重要推動作用。視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)是細胞周期調(diào)控中起關鍵作用的抑制因子,可以抑制完成細胞周期所需基因的表達。在感覺前體細胞中定向敲除Rb基因,可使前體細胞長時間處于增殖狀態(tài),并分化出大量毛細胞和支持細胞。但Rb基因在小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)定向敲除后,雖然毛細胞也能進入細胞周期,但并不能完成分裂并引起細胞的增殖,反而啟動了細胞凋亡。目前,Rb在耳蝸支持細胞的表達和作用并不明確。本課題通過在出生后的小鼠耳蝸支持細胞內(nèi)定向敲除Rb基因,對哺乳動物耳蝸支持細胞在毛細胞再生中的潛能進行研究,以期為耳蝸毛細胞再生的機制研究和臨床治療提供更有效的方案。 (1)建立檢測Cre重組酶活性的指示模型小鼠。①將Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-LacZ指示小鼠相雜交,獲取Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠,從而在具有Cre重組酶活性的細胞中表達β-半乳糖酐酶(β-gal)。②通過X-gal染色,檢測耳蝸中的β-gal活性,從而顯示Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中具有Cre重組酶活性的細胞。 (2)誘導Cre重組酶活性。分別在P0和P1,按每日1次,每次3mg/40g體重劑量,對新生的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠進行腹腔注射tamoxifen。 (3)檢測經(jīng)tamoxifen誘導后的Prox1-CreERT2小鼠耳蝸內(nèi),Cre重組酶活性的分布情況。①對新生的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠進行腹腔注射tamoxifen,時間和劑量同上,以誘導Cre重組活性。②對接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠,在P6采集其耳蝸進行冰凍切片和耳蝸鋪片,利用X-gal染色并結(jié)合毛細胞特異性標記抗體Myo7a的雙重染色,以顯示具有Cre重組酶活性的細胞及其相對于耳蝸毛細胞的位置。 (4)Cre重組酶活性在不同支持細胞亞型中的分布情況。①將Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-EYFP指示小鼠相雜交,獲取Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠,從而在具有Cre重組酶活性的細胞中表達增強的黃色熒光蛋白(EYFP).②對Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠進行tamoxifen腹腔注射,時間和劑量同上,以誘導Cre重組活性。③對接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠,在P4采集耳蝸,制作鋪片,利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡的三維重建技術,觀察耳蝸內(nèi)表達EYFP的細胞,并分析其與毛細胞和支持細胞的關系,使EYFP陽性細胞的細胞類型得到進一步確定。 (1)建立耳蝸支持細胞中定向敲除Rb基因的小鼠模型。①將Prox1-CreERT2小鼠與RbloxP/loxP小鼠雜交,獲取Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠。②分別于P0和P1腹腔注射tamoxifen,劑量同前,以誘導Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠體內(nèi)發(fā)生Cre重組酶介導的Rb基因敲除。 (2)檢測耳蝸支持細胞失去Rb作用后是否重新進入了細胞周期。①接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠(即Prox1-Rb-/-小鼠),在P4或P6對其進行BrdU或EdU的腹腔注射,以標記此時重新進入細胞周期的耳蝸支持細胞。②通過免疫熒光染色(適用于BrdU)或共價疊氮反應(適用于EdU),并結(jié)合毛細胞或支持細胞特異性標記蛋白的雙重熒光染色,檢測重新進入細胞周期的耳蝸支持細胞。③在Prox1-Rb-/-耳蝸頂、中、底回的相應位置,分別對BrdU陽性支持細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。④將Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)增殖性的支持細胞分布,與Prox1-CreERT2小鼠耳蝸內(nèi)Cre重組酶的分布情況進行比較與分析。 (3)檢測耳蝸支持細胞失去Rb作用后是否可以完成細胞周期并增殖。①檢測Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)BrdU陽性細胞的染色質(zhì)凝集現(xiàn)象,以及其支持細胞pH3的分子表達情況,以研究通過限制點和S期的Prox1-Rb-/-耳蝸支持細胞能否進入M期。②在Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)進行BrdU和FISH(可檢測DNA處于已被復制狀態(tài)還是未被復制狀態(tài))的雙重染色,以研究重新進入細胞周期的支持細胞是否可以完成有絲分裂。③對Prox1-Rb-/-小鼠進行BrdU和EdU的雙重標記,以研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細胞是否具有多次進入細胞周期的潛能。④通過外指細胞和柱細胞的計數(shù)統(tǒng)計,以研究失去Rb作用的耳蝸支持細胞是否真正產(chǎn)生了增殖反應。 (1)觀察Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸中的細胞凋亡情況。①對不同日齡的Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸進行TUNEL染色,以檢測最早出現(xiàn)凋亡的時間和支持細胞亞型。②在P9對Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片中的TUNEL陽性細胞進行統(tǒng)計,并與對照組比較以了解Rb基因缺陷的支持細胞凋亡情況。③對不同日齡Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片進行Myo7a或Myo6免疫熒光染色,以檢測毛細胞數(shù)量是否受到影響。 (2)研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細胞在增殖后的細胞分化命運。①分別在P4-P5或P8-P14每日1次對Prox1-Rb-/-小鼠進行EdU的腹腔注射,通過EdU染色結(jié)合毛細胞和/或支持細胞特異性標記蛋白Myo6、Prox1和Sox2的多重熒光染色,以檢測Rb基因缺陷的支持細胞在增殖過程中的分化命運。②研究在耳蝸內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性毛細胞丟失的情況下,其分化是否會受到影響,探討如何對哺乳動物耳蝸支持細胞進行適當?shù)恼{(diào)控,可以使其對毛細胞再生發(fā)揮最大的潛能。 分別在P0和P1,按3mg/40g體重劑量腹腔注射tamoxifen, Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中Cre重組酶的活性局限于外指細胞和柱細胞內(nèi)。而且,具有重組酶活性的細胞數(shù)量從耳蝸底回至頂回呈逐漸上升的趨勢。在Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠耳蝸頂回的EYPF陽性細胞中,外指細胞和柱細胞分別為72.77%±1.12%和27.23%±1.12%,即具有Cre重組酶活性的支持細胞大多為外指細胞。 在Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸內(nèi),發(fā)現(xiàn)外指細胞和柱細胞部位有BrdU陽性細胞出現(xiàn)。在毛細胞分布的位置有時也會發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞,但這些細胞都表達支持細胞抗原Prox1,而不表達毛細胞抗原Myo7a。從耳蝸底回至頂回,BrdU陽性支持細胞的數(shù)量呈漸增的趨勢。在P4時,BrdU陽性的柱細胞數(shù)量明顯多于外指細胞。至P6時,與對照組相比,Rb基因缺失后支持細胞數(shù)量明顯增多。 Rb基因缺失的外指細胞和柱細胞都可進入細胞有絲分裂期(M期),表達M期特有的蛋白和具有M期特征性的凝集染色質(zhì)。在P6的BrdU陽性柱細胞,發(fā)現(xiàn)其僅含2個FISH信號點,顯示G1期或早期S期的特征,表明其重新進入細胞周期后已完成了細胞分裂。在Prox1-Rb-/-耳蝸中還發(fā)現(xiàn)有BrdU/EdU雙重染色陽性的柱細胞存在,提示其具有進行多次細胞分裂的潛能。 在P5之前的Prox1-Rb-/-耳蝸切片上,并未見到Corti器內(nèi)出現(xiàn)TUNEL陽性的支持細胞,而在P7的Prox1-Rb-/-耳蝸鋪片上,我們首先觀察到了Corti器中的凋亡細胞。從TUNEL染色陽性細胞位置推測,這些最早出現(xiàn)死亡信號的細胞很可能是那些細胞核遷移至毛細胞層的外指細胞。之后Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸繼發(fā)毛細胞死亡,其毛細胞數(shù)量在P9并未發(fā)生顯著改變,但在P12的耳蝸頂回可見零星的毛細胞丟失,在出生后7周的耳蝸鋪片上可見更嚴重的毛細胞丟失。并且在P12和P21耳蝸頂回的毛細胞丟失比底回更嚴重。5周齡的Prox1-Rb-/-小鼠聽性腦干反應(ABR)測試顯示聽閾上升,聽覺能力明顯低于對照組。 在P4時,Peox1-Rb-/-耳蝸所有EdU陽性細胞均可被Prox1和Sox2所標記,證實了增殖中的Rb基因缺陷的支持細胞在重新進入細胞周期后仍保持支持細胞的分化命運。在有毛細胞丟失的位置,增殖約1周的外指細胞和柱細胞也仍保持支持細胞命運,所有EdU陽性的耳蝸支持細胞在P14均可表現(xiàn)Sox2的雙重標記,并且未發(fā)現(xiàn)任何EdU和Myo6雙重陽性的細胞。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R764

【共引文獻】

相關期刊論文 前10條

1 倪坤;黃紅彥;;bHLH轉(zhuǎn)錄因子在耳蝸發(fā)育中的作用[J];國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2006年06期

2 任毅;尹時華;;內(nèi)耳毛細胞再生的基因調(diào)控與基因治療研究進展[J];廣西醫(yī)科大學學報;2009年03期

3 邵貝麗;嚴繼舟;;轉(zhuǎn)基因斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)的形成及其對新霉素的抗性[J];淡水漁業(yè);2014年01期

4 ;Recent progresses in stem cell research and hearing restoration[J];Journal of Otology;2008年01期

5 Lauren A.Kilpatrick;Devadoss J Samuvel;Nancy Smythe;;Ouabain-Induced Auditory Nerve Degeneration in Congenic Ly5.1 Mice[J];Journal of Otology;2011年02期

6 李春暉;杜波;丁大連;杜寶東;;小鼠耳蝸的形態(tài)學發(fā)育過程[J];解剖科學進展;2008年02期

7 熊敏,姜泗長,顧瑞,楊偉炎,翟所強,張素珍;堿性成纖維細胞生長因子及成纖維細胞生長因子受體在豚鼠前庭中的定位和表達[J];軍醫(yī)進修學院學報;2000年01期

8 鄧曉聰;楊新明;;哺乳動物內(nèi)耳毛細胞的再生和功能恢復的研究進展[J];南通大學學報(醫(yī)學版);2013年02期

9 孫建軍,汪吉寶;內(nèi)耳聽覺上皮再生的研究[J];神經(jīng)解剖學雜志;1997年02期

10 陳道森;熊鷹;;Sox2在內(nèi)耳發(fā)育中的作用[J];生命科學;2011年01期

相關博士學位論文 前10條

1 余蓉;gfi1.2基因在斑馬魚內(nèi)耳發(fā)育中的功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

2 閆曦;間充質(zhì)干細胞用于實體組織治療的潛在機制分析及在肺照射損傷模型中的應用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

3 顧鳳明;加壓素對大鼠內(nèi)耳基因表達影響的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2005年

4 林順漲;小鼠胚胎耳蝸輻射損傷后毛細胞再生及其機理的研究[D];第四軍醫(yī)大學;1997年

5 王寶東;鐵缺乏致聾相關蛋白質(zhì)表達譜的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2007年

6 王國建;耳聾基因診斷的臨床實踐[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

7 袁偉;腺病毒介導的A20基因?qū)Χ伱毎Ｗo作用的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

8 徐延軍;老年性聾小鼠Math1基因?qū)胝T導耳蝸毛細胞再生的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2009年

9 徐金操;Math1基因誘導成年大鼠前庭毛細胞再生的在體實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2009年

10 袁先道;人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導內(nèi)耳毛細胞樣細胞的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2009年

相關碩士學位論文 前10條

1 李利;胚胎干細胞大鼠內(nèi)耳導入后的遷移與分化[D];南京醫(yī)科大學;2010年

2 袁分錢;Hath1基因和DAPT治療大鼠耳聾的初步研究[D];福建醫(yī)科大學;2011年

3 趙壯;斑馬魚藥源性耳毒模型的建立及應用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

4 陳平;水楊酸鈉作用后大鼠耳蝸基因表達譜改變的研究[D];武漢大學;2004年

5 楊陽;神經(jīng)干細胞耳蝸移植——圓窗膜和耳蝸底轉(zhuǎn)途徑的比較[D];鄭州大學;2005年

6 王斌;神經(jīng)干細胞耳蝸移植中白介素-6的毒性及丹參酮ⅡA的保護作用[D];鄭州大學;2005年

7 張媛;大鼠耳蝸大上皮嵴細胞的體外培養(yǎng)與誘導分化及大、小上皮嵴細胞永生化細胞系的建立[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

8 陳偉;Hath1基因內(nèi)耳導入治療噪聲性聾的實驗研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

9 任毅;NGB基因轉(zhuǎn)染對慶大霉素致豚鼠耳聾保護作用的實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學;2009年

10 張麗新;成體小鼠胰腺干/祖細胞的活體追蹤和離體鑒定研究[D];東北林業(yè)大學;2008年

，

本文編號：2273860