【摘要】： 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是耳鼻喉喉頭頸外科常見(jiàn)惡性腫瘤,好發(fā)于我國(guó)南方及東南亞地區(qū)。病因?qū)W研究表明,鼻咽癌的發(fā)病與EB病毒感染、遺傳易感性、飲食習(xí)慣及某些環(huán)境理化因素有關(guān),其發(fā)生也是一個(gè)多基因參與、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,其中,EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)扮演重要角色。在EB病毒編碼的眾多蛋白當(dāng)中,潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1, LMP1)是目前唯一證實(shí)的惡性轉(zhuǎn)化基因。脫氧核酶(deoxyribozyme, DNAzyme,DZ)技術(shù)作為一種新型的基因治療工具,能有效抑制目的基因表達(dá),已廣泛應(yīng)用于腫瘤、病毒的基因治療研究當(dāng)中。本課題針對(duì)EBV-LMP1mRNA,設(shè)計(jì)并合成具有高效抑制性及特異性的脫氧核酶,觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型中EBV- LMP1基因表達(dá)的抑制作用以及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生的生物學(xué)影響,為鼻咽癌的預(yù)防和臨床治療提供新的基因治療策略。 第一部分脫氧核酶抑制鼻咽癌細(xì)胞EBV-LMP1基因表達(dá)的研究 目的:根據(jù)前期研究結(jié)果,合成高效特異抑制EBV-LMP1基因表達(dá)的靶向脫氧核酶,并觀察其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞內(nèi)靶基因的抑制效應(yīng)。 方法:以EBV-LMP1基因?yàn)橐种瓢悬c(diǎn),合成脫氧核酶DZ509(經(jīng)前期細(xì)胞外分子水平切割篩選,證明具有高效性和特異性)、以及相對(duì)應(yīng)的突變體mutDZ509(15nt堿基活性中心第4位點(diǎn)突變)和反義寡核苷酸ASODN509(有相同底物識(shí)別序列但無(wú)酶活性),5’端用FITC標(biāo)記,并進(jìn)行硫代化修飾,經(jīng)脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞,命名為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組。同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組及僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24h,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。采用RT-PCR、Western Blot方法檢測(cè)其抑制LMP1mRNA和蛋白表達(dá)的效率。 結(jié)果:轉(zhuǎn)染后24h, DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組轉(zhuǎn)染效率分別為64%、60%及65%。RT-PCR結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比,脂質(zhì)體對(duì)照組對(duì)EBV-LMP1mRNA表達(dá)抑制率為5.94%,差異無(wú)顯著性(P0.05);而ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1基因表達(dá),其抑制率分別為23.33%、53.18%、68.76%,其抑制效應(yīng):ASODN509mutDZ509 DZ509,各組間比較,差異有顯著性。其中,DZ509組與mutDZ509組相比,P0.05;DZ509組與ASODN509組相比, P0.01;mutDZ509組與ASODN509組相比,P0.05。Western Blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR基本一致。與空白對(duì)照組相比,脂質(zhì)體組對(duì)EBV-LMP1蛋白表達(dá)抑制率為1.68%,差異無(wú)顯著性(P0.05);ASODN509、mutDZ509、DZ509都能不同程度抑制EBV-LMP1蛋白表達(dá),抑制率各為22.14%、50.39%、68.21%,其抑制效應(yīng):ASODN509mutDZ509 DZ509,各組間比較,差異有顯著性。其中,DZ509組與mutDZ509組相比,P0.05; DZ509組與ASODN509組相比, P0.01;mutDZ509組與ASODN509組相比, P0.05。 結(jié)論:與mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能高效抑制鼻咽癌細(xì)胞中EBV-LMP1基因表達(dá),為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。 第二部分EBV-LMP1靶向脫氧核酶對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的:探討靶向脫氧核酶對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。 方法:將脫氧核酶DZ509、相對(duì)應(yīng)的突變體mutDZ509、無(wú)酶活性的反義寡核苷酸ASODN509經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至C666-1細(xì)胞,分別命名為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組。同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組及僅轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后24h、48h及72h,采用MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖情況。轉(zhuǎn)染后24h,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的細(xì)胞周期;采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果:MTT結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后24h,與空白對(duì)照組相比,脂質(zhì)體組細(xì)胞增殖抑制率為5%,差異無(wú)顯著性(P0.05); DZ509組、mutDZ509組和ASODN509組細(xì)胞增殖抑制率分別為31%、16%、14%,組間比較差異有顯著性(P0.05),抑制效應(yīng):ASODN509mutDZ509 DZ509。轉(zhuǎn)染后48h, DZ509、mutDZ509、ASODN509對(duì)細(xì)胞增殖抑制明顯減弱,抑制率分別為19%、7%和6%,其中,DZ509組與mutDZ509組、ASODN509組比較,差異有顯著性(P0.05);mutDZ509組與ASODN509組相比,差異無(wú)顯著性(P0.05)。轉(zhuǎn)染后72h結(jié)果與48h基本一致。 轉(zhuǎn)染后24h,流式細(xì)胞儀檢測(cè)C666-1細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:對(duì)于G0/G1期比率,與空白對(duì)照組50.28%相比,脂質(zhì)體組為55.23%,差異無(wú)顯著性(P0.05);DZ509組為68.46%,差異有顯著性(P0.05)、mutDZ509組、ASODN509組分別為63.72%和62.23%,差異無(wú)顯著性(P0.05),其中DZ509組和mutDZ509組、ASODN509組比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)。mutDZ509組與ASODN509組比較,差異無(wú)顯著性(P0.05);對(duì)于S期所占比率,與空白對(duì)照組39.30%相比,脂質(zhì)體組為33.72%,差異無(wú)顯著性(P0.05);DZ509組為12.37%,差異有顯著性(P0.05);mutDZ509組、ASODN509組分別為27.05%和28.77%,差異無(wú)顯著性(P0.05),其中DZ509組和mutDZ509組、ASODN509組比較,差異有顯著性(P0.05)。mutDZ509組與ASODN509組比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)算凋亡率,轉(zhuǎn)染后24h,與空白對(duì)照組相比,脂質(zhì)體組細(xì)胞凋亡率為0.48%,差異無(wú)顯著性(P0.05);DZ509、mutDZ509、ASODN509組細(xì)胞凋亡率約為16.64%、10.47%、8.81%,其凋亡誘導(dǎo)效應(yīng):ASODN509mutDZ509 DZ509,差異有顯著性(P0.05)。 結(jié)論:較mutDZ509、ASODN509相比,DZ509能明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯于G0-G1期,DNA合成減少,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 第三部分EBV-LMP1靶向脫氧核酶對(duì)裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 目的:建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型;觀察靶向脫氧核酶、突變脫氧核酶及反義寡核苷酸對(duì)移植瘤生長(zhǎng)及LMP1表達(dá)的影響。 方法:將鼻咽癌細(xì)胞C666-1種植于裸鼠皮下,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。成瘤后,將裸鼠隨機(jī)分為DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組、PBS組,每組各7只,每天于瘤體內(nèi)分別多點(diǎn)注射脫氧核酶DZ509、突變體mutDZ509、反義寡核苷酸ASODN509及對(duì)照PBS,觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。7天后處死裸鼠。剝離腫瘤組織,RT-PCR檢測(cè)LMP1mRNA表達(dá)、Western Blot、免疫組織化學(xué)檢測(cè)LMP1蛋白表達(dá)。 結(jié)果:成功建立裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型。經(jīng)DZ509、mutDZ509、ASODN509和PBS干預(yù)后, DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組、PBS組瘤體重量分別為(0.225±0.05)g、(0.4±0.08)g、(0.475±0.15)g、(1.125±0.25)g。與PBS組相比,DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組腫瘤重量均減輕、差異有顯著性(P0.05);DZ509組與mutDZ509組、ASODN509組比較,腫瘤重量減輕,差異有顯著性(P0.05);而mutDZ509組與ASODN509組比較,差異無(wú)顯著性(P0.05)。對(duì)腫瘤組織RNA行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,以PBS組為對(duì)照,各組對(duì)LMP1mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng):ASODN509mutDZ509 DZ509,抑制率分別為19.34%、45.36%、62.89%,組間比較差異有顯著性。其中,DZ509組與mutDZ509組相比,P0.05;DZ509組與ASODN509組比較, P0.01;mutDZ509組與ASODN509組比較, P0.05。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,以PBS組為對(duì)照,各組對(duì)LMP1蛋白的抑制效應(yīng)ASODN509mutDZ509 DZ509,抑制率分別為18.45%、42.34%、63.13%,差異有顯著性。其中,DZ509組與mutDZ509組相比,P0.05;DZ509組與ASODN509組比較, P0.01;mutDZ509組與ASODN509組比較, P0.05。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:經(jīng)DZ509、mutDZ509、ASODN509及PBS處理后,各組腫瘤組織切片LMP1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比率分別為:21.8%、38.5%、52.5%、69.3%,其比例: DZ509mutDZ509ASODN509 PBS。與PBS組相比,DZ509組、mutDZ509組、ASODN509組LMP1蛋白表達(dá)減少,各組比較,差異有顯著性。其中,其中,DZ509組與mutDZ509組相比,P0.05;DZ509組與ASODN509組比較,P0.01;mutDZ509組與ASODN509組比較, P0.05。 結(jié)論:靶向LMP1脫氧核酶DZ509在裸鼠體內(nèi)能明顯抑制移植瘤的生長(zhǎng),抑制LMP1mRNA及蛋白表達(dá),有望成為治療鼻咽癌有效的基因藥物。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2261728