【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種由高血糖癥(hyperglycemia)造成的常見疾病,其發(fā)病率在發(fā)達國家和發(fā)展中國家均呈升高趨勢。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR),或稱糖網(wǎng)病,是糖尿病的常見并發(fā)癥之一,可引起視覺功能的減退,甚至導致失明。DR不僅損傷視網(wǎng)膜的血管系統(tǒng),還可破壞視網(wǎng)膜神經(jīng)系統(tǒng)。雖然已有大量研究報道糖尿病患者和糖尿病模型動物的視網(wǎng)膜神經(jīng)元受損及發(fā)生退行性的病變,然而,對于視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能在糖尿病狀態(tài)下所產(chǎn)生的變化及其生理機制,目前仍不清楚。這是對DR的治療和預防尚缺乏有效手段的重要原因之一。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(ganglion cell，，GC)是視網(wǎng)膜中的第三級神經(jīng)元,也是視網(wǎng)膜唯一的輸出神經(jīng)元。它們接收并整合來自各種上級神經(jīng)元的視覺信號,包括雙極細胞的興奮性輸入,以及無長突細胞的抑制性輸入；對這些信號進行初步加工后,以動作電位的形式向高級視覺中樞傳遞。所以,GC在視網(wǎng)膜信號處理過程中扮演重要角色,其功能異常往往導致嚴重的視覺疾病。GC位于視網(wǎng)膜表面,易于觀察、記錄,近年來對其研究不斷取得進展,但在單細胞層次研究糖尿病影響GC功能的工作非常罕見。在本研究中,我們通過在單細胞水平,大樣本分析糖尿病動物GC的電生理活動,探索視網(wǎng)膜神經(jīng)環(huán)路在糖尿病狀態(tài)下的變化。在本工作中,我們采用STZ誘導產(chǎn)生Ⅰ型糖尿病的C57小鼠作為動物模型,在糖尿病發(fā)病3～4個月時,觀察了暗適應狀態(tài)下視網(wǎng)膜鋪片標本中GC的生理活動,包括GC的對光反應和自發(fā)放電活動；并使用細胞染色和計數(shù)技術,觀察了視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的情況。小鼠經(jīng)腹腔注射STZ后,血糖值顯著上升并保持在高水平,且體重的變化以及多飲多尿的特點均符合Ⅰ型糖尿病的特征,表明我們所建立的動物疾病模型有效、可靠。在成功誘導高血糖癥3～4個月后,我們采用非緊密封接的細胞貼附式膜片鉗記錄(即loose-patch)法,在暗適應后的小鼠視網(wǎng)膜鋪片標本上,對GC進行記錄。在接受光刺激后,正常視網(wǎng)膜中的絕大多數(shù)GC可產(chǎn)生ON型和/或OFF型光反應,根據(jù)以上反應極性,可將GC分為ON-GC、OFF-GCC和ON-OFF-GC這三種基本的生理學亞型。我們觀察到,在糖尿病情況下,有相當一部分GC失去了對光反應能力。這一現(xiàn)象初步提示,糖尿病影響了GC的基本生理反應,這可能導致視覺功能的損傷。本工作的主要研究對象,是小鼠視網(wǎng)膜GC在暗中的自發(fā)動作電位發(fā)放(即自發(fā)放電)情況。我們對各亞型GC的自發(fā)放電活動進行連續(xù)的loose-patch記錄,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,取時長為1分鐘的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。我們觀察到,GC的自發(fā)放電頻率在不同神經(jīng)元之間差異很大；對三個亞類的GC分別進行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)ON-和OFF-GC的自發(fā)放電頻率分布均呈現(xiàn)非正態(tài)分布的特征。STZ誘導產(chǎn)生糖尿病3個月后,ON-GC的自發(fā)放電頻率顯著高于對照組,且成簇發(fā)放(burst)增多,表現(xiàn)為成簇發(fā)放的頻率,及其所占時間在細胞總的活動時間中的比例均顯著增高。我們所記錄到的OFF-和ON-OFF-GC的數(shù)目遠比ON-GC要少,在現(xiàn)有的樣本量基礎上進行的分析顯示,它們的自發(fā)放電頻率在糖尿病組和對照組間均沒有差異。我們進而使用藥理學手段,進一步探討糖尿病動物ON-GC自發(fā)放電增強的可能機制。在暗中,當使用突觸阻斷劑混合物阻斷視網(wǎng)膜內(nèi)主要的化學突觸傳遞后,正常小鼠視網(wǎng)膜ON-GC的自發(fā)放電活動能夠被完全壓抑,表明這種活動是完全依賴于突觸輸入的。在糖尿病中,大部分ON-GC保持這種生理特性,而有一部分的ON-GC出現(xiàn)了突觸輸入非依賴的自發(fā)放電活動。提示糖尿病可能改變了一部分ON-GC的內(nèi)源性電生理特性。GABA受體和甘氨酸受體介導視網(wǎng)膜內(nèi)主要的抑制性信號傳遞。在Ringer's液中施加以上兩種受體的拮抗劑,阻斷對ON-GC的抑制性輸入后,糖尿病組和對照組ON-GC的自發(fā)放電頻率均出現(xiàn)升高,且升高后的放電頻率在兩組之間沒有統(tǒng)計學上的差異。該結果與正常Ringer's液中糖尿病組ON-GC的自發(fā)放電頻率顯著高于對照組的現(xiàn)象相結合,提示在糖尿病狀態(tài)下,上級神經(jīng)元對ON-GC的抑制性輸入是減弱的,這可能是造成ON-GC自發(fā)活動增多的主要機制之一；另一方面,該結果也提示,暗適應中的ON-GC所接受的興奮性輸入,在糖尿病狀態(tài)下并未發(fā)生改變。我們對小鼠全視網(wǎng)膜鋪片進行TUNEL標記,并使用DAPI復染來確認視網(wǎng)膜神經(jīng)元的位置,以排除TUNEL檢測時假陽性信號的干擾。使用Neurolucida系統(tǒng)統(tǒng)計TUNEL信號的結果顯示,與對照組相比,糖尿病3個月時,單位面積視網(wǎng)膜中的TUNEL陽性信號總數(shù)沒有顯著變化。此結果提示,在我們的動物模型所處的糖尿病早期階段,視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡水平尚未受到明顯影響。綜上所述,我們得到的結論是：在STZ誘導的糖尿病發(fā)病3個月時,雖然小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元未發(fā)生大規(guī)模的凋亡,然而此時GC的生理功能已經(jīng)受到了顯著的影響,這些影響包括：GC對光反應能力的丟失、ON-GC自發(fā)活動水平的增高、內(nèi)源性電生理特性可能發(fā)生的改變以及其所接受的抑制性突觸輸入的減弱等。這些發(fā)現(xiàn)將為我們進一步認識早期糖尿病時,視網(wǎng)膜神經(jīng)元生理功能的變化及其機制提供重要信息,并可能為尋找治療、控制糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點提供有益的參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R774.1

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