【摘要】：第一部分Ⅳ型Bartter綜合征遺傳學分析 背景：Bartter綜合征(Bartter syndrome, BS)是一組臨床表現為腎性失鹽、低鉀血癥、代謝性堿中毒、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增強的遺傳性疾病,主要為常染色體隱性遺傳。根據不同的臨床特點,可將BS分為3型：經典型BS(包括Gitelman綜合征)、新生兒型BS、新生兒型BS伴感音神經性耳聾。迄今為止,已發(fā)現6個與BS有關的常染色體基因：NKCC2、ROMK、CLCNKB、 BSND、CLCNKA、 NCCT。根據遺傳學的特征,可將BS分為6型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型,其中Ⅳ型、Ⅴ型為新生兒型伴感音神經性耳聾,Ⅵ型為Gitelman綜合征。 目的：本研究小組收集了一個Bartter綜合征的散發(fā)病例,患者同時伴有感音神經性耳聾,擬通過分析臨床特征與基因突變檢測尋找病因。 方法：對患者及父母進行了病史采集、體格檢查及輔助檢查,并選取100名正常人群作為對照組,進行了GJB2、BSND、CLCNKA、 CLCNKB等四個基因的外顯子篩查。 結果：患兒的臨床表現為：新生兒期發(fā)病,腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增高,低鉀血癥、低氯血癥,生長發(fā)育遲緩,神經性耳聾,腎臟影像學無明顯異常,具有羊水過多和早產史,符合IV型Bartter綜合征的典型癥狀。同時,患兒的BSND基因第一個外顯子存在純和突變c.22CT和c.127GA, GJB2基因存在復合雜合突變即c.235delC和c.109GA。而患兒父母BSND基因均存在雜合突變c.22CT和c.127GA,父親GJB2基因存在雜合突變c.109GA,母親GJB2基因存在雜合突變c.235delC�；純杭案改妇窗l(fā)現CLCNKA和CLCNKB基因的變異。正常對照組中37例存在BSND c.127位雜合等位基因G/A,2例存在BSND基因c.127位純和等位基因A/A。 結論：1.本研究所報道的Ⅳ型Bartter綜合征患者同時攜帶BSND與GJB2基因變異屬世界首次報道；2.患兒Ⅳ型BS是由BSND基因純和突變c.22CT導致,而患兒GJB2基因的復合雜合突變可能在耳聾發(fā)生過程中有一定的作用；3.患兒攜帶的BSND基因變異c.127GA為單核苷酸多態(tài)性。 第二部分Goldengate耳聾基因芯片的優(yōu)化設計 背景：耳聾是最常見的感覺神經性疾病,它不僅是造成聽力殘疾、影響人類身心健康的疾病,而且給患者的生活、家庭、工作和學習中的交流帶來極大的不便。與此同時,耳聾也給社會帶來了沉重的負擔。據報道,全球有2.5億人患有中度以上聽力損失。耳聾遺傳學研究表明,人類23對染色體中的22對都分布有耳聾遺傳位點,線粒體基因也與耳聾相關。約有半數的先天性耳聾與遺傳因素有一定聯系。隨著遺傳學的發(fā)展,逐漸衍生出一些基因診斷手段,然而這些方法無法同時具備高通量、覆蓋面廣、低成本、高準確性的特征,因此對遺傳性耳聾的基因診斷需要進行革命性的改革。在本課題組的前期工作中,設計了具有384個位點的Goldengate耳聾基因芯片。其中包括240個耳聾相關突變位點(77個顯性突變位點及163個隱性突變位點)和144個SNP位點。應用該耳聾基因芯片對465個DNA模板進行篩查,統(tǒng)計分析了芯片Call rate、SNP位點的等位基因頻率。結果顯示,芯片總Call rate為96.32%; GJB2_235delC檢測位點的假陽性率為3.1%,假陰性率為0；對一個非綜合征型顯性遺傳耳聾家系進行SNP位點的連鎖分析,其結果與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描方法的定位結果相似,認為該芯片具備初步進行耳聾相關基因的排除定位連鎖分析的能力。然而,芯片結果存在目前不能解釋的疑點：第一,初步應用過程中發(fā)現部分不常見突變位點在檢測過程中出現較高的陽性檢測率,如PJVK_988delG為57.36%、SLC26A4_Gly497Ser為7.14%；第二,部分位點的call rate較低；第三,部分患者為多種基因突變位點的攜帶者或純合子基因型；第四,部分正常人群的檢測結果存在一種或多種突變,但并未有耳聾的表現�；谝陨显�,為了獲取具有更高準確性、更具合理性的芯片,本課題小組擬將芯片進行進一步驗證,并根據驗證結果優(yōu)化芯片中的耳聾突變檢測位點及SNP位點。 目的：驗證第一版Goldengate耳聾基因芯片的準確性。在符合臨床特點及應用的基礎上,根據第一版芯片的經驗優(yōu)化Goldengate耳聾基因芯片,使其符合中國耳聾人群遺傳學特點,具有應用性與合理性。 方法：第一版Goldengate耳聾基因芯片共有384個位點,隨機挑選芯片中19個突變檢測位點,應用Sanger測序法驗證其敏感性和特異性。結合驗證結果優(yōu)化第一版芯片位點。通過文獻檢索法統(tǒng)計目前國內外已報道的所有耳聾相關突變位點,篩選位點時結合臨床應用,首要原則為：世界范圍內突變位點報道次數大于2次,以中國人群報道次數較多的位點為主。在滿足第一原則的基礎上,其他輔助原則為：(1)相鄰兩個位點至少間隔60堿基以上；(2)盡量選擇探針評分大于0.6的位點,熱點突變位點探針評分在0.5-0.6之間也可納入芯片；(3)點突變優(yōu)先于長缺失及插入突變；(4)排除第一版芯片中call rate低于70%的位點。SNP位點的替換原則如下：(1)SNP位于亞洲人群中報道的已克隆耳聾相關基因；(2)與以上選取的耳聾致病突變位點間隔60bp及以上；(3)SNP位點探針評分大于0.6；(4)點突變優(yōu)先于長缺失及插入突變；(5)剔除第一版芯片中call rate分數低于0.6的SNP位點。將優(yōu)化設計后的384個位點的探針評分與前期芯片的評分進行t檢驗比較,初步判斷芯片位點選擇的合理性。 結果：1.第一版Goldengate耳聾基因芯片位點的敏感性從0%-100%不等,特異性均為100%；2.優(yōu)化后的第二版耳聾芯片中包含200個非綜合癥耳聾位點、40個常見綜合征耳聾位點,以及144個SNP位點；3.耳聾突變位點包含中國人群最常見的8個熱點突變,如下：GJB2_1_BP_DEL_35delG、GJB2_1_BP_DEL_235C、 GJB2_2_BP_DEL_299_300at、GJB3_Arg180Term[C/T] SLC26A4_Asn392Tyr[A/T]、SLC26A4_IVS7_2[A/G] SLC26A4_His723Arg[A/G]、線粒體12rsRNA1555[A/G];4.第二版芯片覆蓋綜合征和非綜合征型耳聾的46個核基因與線粒體基因；5.兩版芯片探針設計評分進行t檢驗,P0.05,統(tǒng)計學上具有顯著性差異；6.第二版芯片位點采用自主性命名,達到實用性強、易解讀、易判斷芯片結果的作用。 結論：1.第一版芯片的特異性高,而敏感性高低不等,其原因可來自位點設計、模板質量等多方面,需進行進一步優(yōu)化；2.第二版Goldengate耳聾基因芯片涵蓋了中國人群常見的非綜合征耳聾突變熱點,并且包含了常見的4種綜合征耳聾基因的突變位點,具有與臨床特點緊密結合、覆蓋面廣、應用性能強的特點。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R764.431;R596.1

【參考文獻】

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