發(fā)布時(shí)間：2018-10-09 10:24

【摘要】： 青光眼、視神經(jīng)外傷、視網(wǎng)膜色素變性等疾病是眼科臨床中高發(fā)的不可逆致盲性眼病,極大地危害了患者的身心健康。由于在成年哺乳動(dòng)物中,損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法再生,故治療效果差,治療手段有限,是臨床上的一大難題。本研究從兩方面著手：一是神經(jīng)軸突受損而神經(jīng)元胞體還存活的病理狀況,我們致力于通過(guò)研發(fā)組織工程神經(jīng)導(dǎo)管促進(jìn)成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)的視神經(jīng)軸突再生來(lái)修復(fù)：另一方面是神經(jīng)細(xì)胞也損傷失活、殘存的神經(jīng)細(xì)胞不足以維持正常神經(jīng)功能的病理狀況,我們將成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)源性因子ephrinA3作為靶點(diǎn),研究其對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)作用,從而為治療各種累及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的疾病打下基礎(chǔ)。 第一部分：一種新的組織工程化導(dǎo)管移植促進(jìn)成年大鼠視神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過(guò)研發(fā)一種新的可降解的組織工程化導(dǎo)管,移植在損傷的視神經(jīng)斷端促進(jìn)成年大鼠的視神經(jīng)軸突生長(zhǎng),從而探索外源性微環(huán)境改變對(duì)促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用。 方法：(1)制備轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞：構(gòu)建GFP-CNTF真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒,用電穿孔法將其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后3小時(shí)—7天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)時(shí)間和轉(zhuǎn)染效率。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染CNTF后24小時(shí),用RT-PCR檢測(cè)CNTF的mRNA表達(dá)情況,并且用免疫組化檢測(cè)CNTF蛋白的表達(dá)情況,從而證實(shí)基因的轉(zhuǎn)染效果。(2)制備組織工程化導(dǎo)管：用PGA細(xì)絲填充于中空的PLGA導(dǎo)管中,然后分別將轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞或單純雪旺細(xì)胞填充入導(dǎo)管,并過(guò)夜培養(yǎng),使細(xì)胞更好地貼附。(3)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：用成年SD大鼠,分成3組,每組6-8只,分別為：①轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組、②雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組、③空導(dǎo)管組。首先手術(shù)造成大鼠視神經(jīng)橫斷傷,然后將各種導(dǎo)管縫合至大鼠視神經(jīng)近側(cè)斷端。(4)評(píng)價(jià)再生效果：導(dǎo)管移植4周后,用再生軸突標(biāo)記物GAP-43抗體標(biāo)染各組導(dǎo)管的冰凍切片,每張切片從視神經(jīng)斷端開(kāi)始,每625微米作為一個(gè)計(jì)數(shù)點(diǎn),每只大鼠取5張切片進(jìn)行計(jì)數(shù)并取得每個(gè)距離計(jì)數(shù)點(diǎn)再生軸突的平均數(shù),然后對(duì)每個(gè)距離計(jì)數(shù)點(diǎn)的再生軸突數(shù)量在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間用One Way Anova進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí),用透射電鏡觀察導(dǎo)管內(nèi)部雪旺細(xì)胞的存活和再生軸突的微細(xì)結(jié)構(gòu)。 (5)觀察導(dǎo)管炎癥及降解情況：用巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42抗體標(biāo)染導(dǎo)管冰凍切片以觀察導(dǎo)管內(nèi)炎癥反應(yīng)的情況,并在移植后4周和2個(gè)月觀察導(dǎo)管材料的降解情況。 結(jié)果：(1)成功制備轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞：測(cè)序證明GFP-CNTF質(zhì)粒構(gòu)建成功,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后3小時(shí)綠色熒光開(kāi)始表達(dá),24小時(shí)達(dá)到高峰,可持續(xù)一周。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞24小時(shí)后,RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞有較高的CNTF mRNA表達(dá),免疫組化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞表達(dá)CNTF,從而證實(shí)了該基因轉(zhuǎn)染方式的有效性。(2)GAP43免疫組化計(jì)數(shù)再生神經(jīng)纖維：將三種導(dǎo)管移植在成年大鼠視神經(jīng)橫斷傷末端4周后,用GAP43標(biāo)染組織工程化導(dǎo)管內(nèi)的再生神經(jīng)纖維。在距離視乳頭1875μm的導(dǎo)管內(nèi)部,單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組再生軸突的數(shù)量(14.3±2.94/mm/section)和轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組再生軸突的數(shù)量(16.2±1.56/mm/section)明顯高于對(duì)照空導(dǎo)管組(5±2.06/mm/section, P＜0.05, one way anova, n=6或8).說(shuō)明該組織工程化導(dǎo)管填充雪旺細(xì)胞后具有明顯的促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用。在離視神經(jīng)斷端約5000μm的導(dǎo)管內(nèi)部,轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為4.23±1.18/mm/section,而單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為1.33±0.58/mm/section,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,t檢驗(yàn),n=6或8)。在離視神經(jīng)約5625μm的導(dǎo)管內(nèi)部,轉(zhuǎn)基因雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為2.86±1.08/mm/section,而單純雪旺細(xì)胞導(dǎo)管組的再生軸突數(shù)量為0.3±0.1/mm/section,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,t檢驗(yàn),n=6或8)。說(shuō)明移植轉(zhuǎn)染CNTF的雪旺細(xì)胞填充的神經(jīng)導(dǎo)管組的再生效果比移植單純雪旺細(xì)胞填充的神經(jīng)導(dǎo)管組好。(3)電鏡觀察再生軸突：導(dǎo)管移植4周后,電鏡觀察見(jiàn)導(dǎo)管內(nèi)轉(zhuǎn)基因的雪旺細(xì)胞導(dǎo)管內(nèi)仍可見(jiàn)存活的雪旺細(xì)胞,并且可見(jiàn)再生神經(jīng)纖維,從而進(jìn)一步證實(shí)了軸突的再生。(4)導(dǎo)管內(nèi)部炎癥情況和導(dǎo)管降解情況的觀察：巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物OX42對(duì)導(dǎo)管冰凍切片的免疫組化染色顯示移植4周后,導(dǎo)管內(nèi)沒(méi)有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。導(dǎo)管在體內(nèi)移植后2個(gè)月后降解。 結(jié)論：我們成功研制了一種新的可降解的組織工程化神經(jīng)導(dǎo)管,可以有效地促進(jìn)成年大鼠的視神經(jīng)再生.該導(dǎo)管的研發(fā)為將來(lái)治療各種神經(jīng)軸突損傷性疾病打下一定研究基礎(chǔ)。 第二部分：EphrinA3對(duì)成年小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖及分化作用的研究 目的：探索ephrinA3在成年小鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞龕內(nèi)的作用,并探討其作用機(jī)制,為尋找新的調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化的靶點(diǎn),從而為調(diào)控視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化,治療各種視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞變性疾病打下基礎(chǔ)。 方法：(1)檢測(cè)ephrinA3在小鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)情況：用Western blot檢測(cè)不同年齡的小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)ephrinA3的表達(dá)趨勢(shì),并用免疫組化的方法觀察在成年小鼠的視網(wǎng)膜ephrinA3的表達(dá)部位。(2)在體實(shí)驗(yàn)觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖情況：用BrdU活體標(biāo)記,免疫組化染色,并在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察成年ephrinA3基因敲除鼠和成年野生鼠體內(nèi)的視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖情況。(3)體外實(shí)驗(yàn)觀察ephrinA3對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的影響：離體培養(yǎng)ephrinA3基因敲除小鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞,比較其形成原代和第二代神經(jīng)球的數(shù)量,另外用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖能力。培養(yǎng)野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞,加入ephrinA3蛋白,比較加入ephrinA3蛋白組和對(duì)照組干細(xì)胞的增殖能力。(4)比較兩種神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況：用Real-timePCR及RT-PCR的方法比較兩種神經(jīng)球的各種干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。(5)比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化情況：體外誘導(dǎo)分化視網(wǎng)膜干細(xì)胞,并用各種細(xì)胞標(biāo)記物標(biāo)染以觀察其分化情況。用Real-time PCR的方法比較干細(xì)胞分化前后干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況,以及比較ephrinA3基因敲除干細(xì)胞和野生型干細(xì)胞分化后各種視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況。(6)ephrinA3受體分子的研究：用RT-PCR檢測(cè)在野生型神經(jīng)球中EphA4和EphA7的表達(dá)情況,并用免疫沉淀檢測(cè)野生鼠睫狀體上皮組織中ephrinA3的相應(yīng)受體,用免疫組化檢測(cè)EphA4在成年小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)部位,并用western blot檢測(cè)ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠睫狀體上皮組織中EphA4磷酸化程度的不同,從而推測(cè)EphA4和ephrinA3之間的關(guān)系。(7)探索ephrinA3作用的下游分子通路：用Wnt3a加入培養(yǎng)的野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞中,通過(guò)檢測(cè)BrdU摻入實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察Wnt3a對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖能力的影響。用Western blot檢測(cè)ephrinA3基因敲除視網(wǎng)膜干細(xì)胞和野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞中Wnt3a的下游通路分子β-catenin的表達(dá)及該分子的磷酸化程度,從而推測(cè)ephrinA3的下游分子通路。 結(jié)果：(1) ephrinA3在小鼠視網(wǎng)膜上的表達(dá)情況：Western blot結(jié)果顯示,ephrinA3從出生后10天開(kāi)始可以在視網(wǎng)膜組織中檢測(cè)得到,在成年期表達(dá)有所增強(qiáng)。在成年小鼠的視網(wǎng)膜,ephrinA3主要表達(dá)在視網(wǎng)膜的內(nèi)叢狀層和外叢狀層,并較低地表達(dá)在睫狀體上皮組織。(2)在體實(shí)驗(yàn)觀察ephrinA3基因敲除鼠和野生鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖情況：通過(guò)BrdU活體標(biāo)記后染色計(jì)數(shù)可知,成年ephrinA3基因敲除鼠睫狀體邊緣部的增殖細(xì)胞數(shù)量為0.0835±0.0478個(gè)／切片,明顯多于成年野生型小鼠睫狀體邊緣部的增殖細(xì)胞數(shù)量0.00337±0.00337個(gè)／切片(P0.05, Mann-Whitney Rank Sum Test, n=9)。而且增殖細(xì)胞可同時(shí)標(biāo)染干細(xì)胞標(biāo)記物Chx10,說(shuō)明這些增殖細(xì)胞為視網(wǎng)膜的干細(xì)胞。(3)體外實(shí)驗(yàn)觀察ephrinA3對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的影響：在離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),ephrinA3基因敲除鼠組所生成的原代神經(jīng)球的數(shù)量是野生型小鼠組的1.72±0.07倍(P＜0.01,t檢驗(yàn),n=3); ephrinA3基因敲除小鼠組生成第二代神經(jīng)球的數(shù)量是野生型小鼠組的2.13±0.235倍(P0.01,t檢驗(yàn),n=3); ephrinA3基因敲除小鼠組的視網(wǎng)膜干細(xì)胞BrdU摻入百分比(57.5%±2.4%)高于野生小鼠組(34%±5.2%)(P0.05,t檢驗(yàn),n=3),說(shuō)明ephrinA3基因敲除組視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖能力高于野生小鼠的視網(wǎng)膜干細(xì)胞。如果在培養(yǎng)皿中加入ephrinA3蛋白,野生型的視網(wǎng)膜干細(xì)胞BrdU摻入百分比會(huì)從原來(lái)的33.8%±0.8%下降至25.6%±0.8%(P0.05,t檢驗(yàn),n=3),進(jìn)一步說(shuō)明了ephrinA3蛋白對(duì)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的抑制性作用。(4)比較兩種神經(jīng)球干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)情況：Real-time PCR結(jié)果證實(shí),phrinA3基因敲除的視網(wǎng)膜干細(xì)胞的各種干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)量高于野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞,尤其是Wnt家族表達(dá)上調(diào)最為明顯。(5)比較兩種視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化情況：分化實(shí)驗(yàn)中證實(shí),視網(wǎng)膜干細(xì)胞可以分化為多種不同種類(lèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。Realtime PCR結(jié)果顯示ephrinA3基因敲除的視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化后比野生型視網(wǎng)膜干細(xì)胞分化后表達(dá)更高的感光細(xì)胞標(biāo)記物rhodopsin和ecoverin,說(shuō)明ephrinA3基因敲除鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞具有更強(qiáng)的分化潛能。(6) ephrinA3受體分子的研究：RT-PCR證實(shí)在視網(wǎng)膜干細(xì)胞內(nèi)EphA4的表達(dá)遠(yuǎn)高于EphA7,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)在睫狀體上皮細(xì)胞內(nèi)EphA4是ephrinA3的受體分子。免疫組化顯示EphA4表達(dá)在睫狀體上皮上。Western blot結(jié)果證實(shí)野生型小鼠的睫狀體上皮組織的EphA4磷酸化程度高于ephrinA3基因敲除鼠的睫狀體上皮組織。證實(shí)EphA4是ephrinA3在睫狀體上皮細(xì)胞上的受體。(7) ephrinA3調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的下游分子通路：加入Wnt3a后,視網(wǎng)膜干細(xì)胞的BrdU摻入百分比明顯升高, Western blot結(jié)果顯示在ephrinA基因敲除鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞原代神經(jīng)球里β-catenin (Wnt3a的下游通道分子)和磷酸化的β-catenin的表達(dá)比野生鼠均有提高,故認(rèn)為而Wnt/β-catenin分子通路可能是ephrinA3參與調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖的的下游通路。 結(jié)論：ephrinA3是小鼠成年視網(wǎng)膜干細(xì)胞龕中的一種內(nèi)源性抑制性分子,它可能通過(guò)視網(wǎng)膜干細(xì)胞上的EphA4受體,調(diào)控下游Wnt/β-catenin分子通路來(lái)抑制視網(wǎng)膜干細(xì)胞的增殖和分化。對(duì)ephrinA3的作用及其機(jī)制的了解,為將來(lái)調(diào)控體內(nèi)視網(wǎng)膜干細(xì)胞增殖和分化,治療臨床疾病方面打下了一定的基礎(chǔ)。下一步將研究敲除遺傳性視網(wǎng)膜變性小鼠體內(nèi)的ephrinA3,觀察其體內(nèi)視網(wǎng)膜干細(xì)胞是否能再生更多的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,從而起到挽救或延遲視網(wǎng)膜病變的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R774

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2258994