本文選題：熱休克轉錄因子4 + 慢病毒載體�。� 參考：《河南大學》2010年碩士論文

【摘要】： 背景 先天性白內障是導致兒童失明的主要原因,大約0.3- 1.5/1000的兒童患有先天性白內障,它的主要病理改變?yōu)榫铙w發(fā)育遲緩,晶狀體內非透明瘢塊組織形成,染色體異常為主要致病原因。已經發(fā)現(xiàn)多種基因的突變體與臨床及動物實驗性先天性白內障發(fā)生有關。例如編碼晶狀體細胞結構蛋白相關基因的突變(MIPs, CP49 and alpha-, beta-和gamma- crystallins)和調控晶狀體發(fā)育相關的轉錄因子的基因突變(Pax6, FoxE3, Six3, Prox1, Sox2/3, Maf, Pitx3, AP-2a和Hsf4)。2002年,BU等對國人一個先天性白內障家系進行連鎖分析時,將致病的基因定位于16號染色體,確定了Hsf4是先天性白內障的候選基因,它的發(fā)生機制為Hsf4基因的第348位核苷酸T突變?yōu)镃,使Hsf4的DNA結合域內的第115位高度保守的亮氨酸轉變?yōu)楦彼?而最終導致白內障的發(fā)生。應用轉基因技術敲除小鼠的Hsf4基因可以使小鼠在出生后3-5天(P3-5)出現(xiàn)白內障,該結果有力的支持Hsf4是調控晶狀體早期發(fā)育的重要轉錄因子的論點。但是,調控Hsf4轉錄活性的信號通路及Hsf4調控晶狀體早期發(fā)育的分子機理還不清楚。因此,研究Hsf4在晶狀體發(fā)育過程中的生物學調控作用對揭示突變型Hsf4的致病機理及早期診斷和治療與Hsf4突變相關的先天性白內障有著重要的意義。為此我們構建了Hsf4的真核表達載體pcDNA3.0/Hsf4b,然而pcDNA3.0/Hsf4b轉染MLEC(Hsf4b-/-)晶狀體上皮細胞的轉染效率較低,對探求Hsf4b調控晶狀體發(fā)育的分子機制的研究較難進行。體外建立一個轉染效率高且穩(wěn)定表達Hsf4b的細胞株對我們進一步研究Hsf4b的生物學功能有重要的意義。 目的 構建Hsf4b的真核表達載體,便于研究Hsf4b在體外的功能。構建Hsf4b的重組慢病毒載體是為了能獲得一株持續(xù)且穩(wěn)定表達Hsf4b的細胞株。為以后繼續(xù)研究Hsf4調控晶狀體發(fā)育的分子機制奠定基礎。 方法 用人心臟cDNA文庫為模板,應用囊括Hsf4b全長的引物進行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag標簽。將PCR產物經Kpn I和EcoR I酶切后,與該二酶線性化pcDNA3.0質粒一起連接獲得重組質粒pcDNA-Flag-Hsf4b;做重組質粒上的定點突變;為了獲得能持續(xù)且穩(wěn)定表達Hsf4b的細胞株,將重組質粒pcDNA-Flag-Hsf4b和慢病毒表達載體Plentiviral用XholI和NdeI酶切后再連接獲得Plentiviral-Flag-Hsf4b質粒,與病毒衣殼蛋白PLP1、PLP2、VSV-G一起轉染入HEK293T細胞,用其分泌的含病毒的上清去感染MLEC細胞,并通過Blascitidin藥物對其進行穩(wěn)定篩選,用Western檢測慢病毒表達載體Plenti/Hsf4b的表達情況,并檢測相應下游蛋白Hsp25的表達。 結果 構建了Hsf4b的真核表達載體pcDNA-Flag-Hsf4b,將其轉入HEK293T細胞顯示能表達相應的蛋白,但是轉染MLEC細胞時轉染效率非常低,Western檢測不到,我們研究發(fā)現(xiàn)其主要原因是重組質粒被轉染入細胞后其表達的相應蛋白又結合于重組質粒的CMV上抑制Hsf4b相關蛋白的進一步表達。將構建好的Hsf4b真核表達載體作CMV上的定點突變,使這種抑制作用解除,最后獲得了pcDNA-Flag-Hsf4b載體的突變體。測序結果及Western結果也證明了突變成功,插入片斷在MLEC細胞中得到了表達。 為了使Hsf4b在MLEC細胞中穩(wěn)定且持續(xù)表達,構建了Hsf4b的慢病毒表達載體并成功篩選出了一株能穩(wěn)定表達Hsf4b的細胞株和一株Plentiviral(空載體)細胞株。Western(蛋白質免疫印跡)檢測其下游小分子熱休克蛋白Hsp25的表達,結果顯示Hsf4b促進Hsp25的表達。 結論 利用基因工程技術,將Hsf4b的cDNA克隆到真核表達載體pcDNA3.0,構建了Hsf4b真核表達質粒pcDNA-Flag-Hsf4b,并在人胚胎腎細胞系293T中成功表達出蛋白。對質粒pcDNA-Flag-Hsf4b上CMV啟動子成功定點突變,獲重組質粒CMVm-Flag- Hsf4b。構建了Hsf4b慢病毒表達載體Plenti-Flag-Hsf4b,并成功轉染至MLEC細胞中。獲得一株穩(wěn)定表達Hsf4b蛋白的細胞株MLEC/Plenti-Hsf4b。MLEC/Plenti-Hsf4b細胞株中小分子熱休克蛋白Hsp25的表達升高。
[Abstract]:Background


In 2002 , it has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract . It has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract . It has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract .


Purpose


The eukaryotic expression vector of HSV4b was constructed to study the function of Hs4b in vitro . The recombinant lentivirus vector was constructed in order to obtain a cell line which was continuously and stably expressing Hs4b . The molecular mechanism of Hsf4 was used to regulate the development of Hsf4 .


method


The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b was digested by KpnI and EcoR I . The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b and lentivirus expression vector were digested with XholI and NdeI .


Results


The eukaryotic expression vector pcDNA - Flag - Hs4b was constructed , and the recombinant plasmid pcDNA - Flag - Hs4b was transfected into the cells . However , the transfection efficiency was very low when transfected into MLEC . The results showed that the recombinant plasmid was transfected into the cells . The results showed that the recombinant plasmid was successfully transfected into the vector . The results of the sequencing and the Western blot showed that the mutation was successful and the inserted fragment was expressed in MLEC .


In order to stably and persistently express HSV4b in MLEC cells , a cell strain expressing Hs4b was constructed and a cell line stably expressing Hs4b was constructed . Western blot was used to detect the expression of Hsp25 in the downstream small molecular heat shock protein .


Conclusion


The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b was constructed and the recombinant plasmid CMVm - Flag - HSV4b was successfully transfected into MLEC .
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R776.1

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 林燕瑜;李青;楊佩菲;;熱休克轉錄因子4與先天性白內障[J];福建醫(yī)藥雜志;2007年04期

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本文編號：2034275